本文關(guān)鍵詞：基于FRET技術(shù)MMP-9生物傳感器的構(gòu)建及鑒定

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【摘要】：為了構(gòu)建包含有增強青色熒光蛋白-MMP-9-黃色熒光蛋白(ECFP-MMP-9-YPet)融合蛋白的真核表達質(zhì)粒MMP-9生物傳感器,利用原有質(zhì)粒Src biosensor和通用載體p MD-18T,通過基因工程的方法構(gòu)建ECFP-MMP-9-YPet生物傳感器并進行鑒定,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24 h后觀察轉(zhuǎn)染效率,然后加MMP-3刺激293T細(xì)胞,運用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(flurorescence resonance energy transfer,FRET)技術(shù)在熒光顯微鏡下觀察MMP-9生物傳感器的熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。PCR和雙酶切鑒定顯示,ECFP-MMP-9-YPet生物傳感器構(gòu)建成功,293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率約40%。用免疫熒光法檢測MMP-9生物傳感器融合蛋白在293T細(xì)胞表面膜表達,用MMP-3刺激轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以檢測到FRET現(xiàn)象。結(jié)果表明,基于FRET構(gòu)建的MMP-9生物傳感器可以敏感而準(zhǔn)確地監(jiān)測活細(xì)胞中MMP-9的表達情況。
【作者單位】： 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科;新疆民族與地方病教育部重點實驗室;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號:81160225,81260453,81360451) 新疆兵團醫(yī)藥衛(wèi)生專項資助(批準(zhǔn)號:2013BA020) 兵團國際交流與合作專項(批準(zhǔn)號:2012BC002,2011BC004) 兵團科技創(chuàng)新團隊專項基金(批準(zhǔn)號:2014CC002)資助的課題~~
【分類號】：R684.3;TP212.3
【正文快照】： 骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是最常見的關(guān)節(jié)疾病,其主要特征是關(guān)節(jié)軟骨退化、軟骨下骨反應(yīng)性增生、關(guān)節(jié)功能障礙。OA病變的主要機制之一是蛋白酶對軟骨的降解,其中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)[1-2]、尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase type plasminogen a

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本文編號：1179689