本文關(guān)鍵詞：CAT、SOD在肝缺血再灌注損傷大鼠小腸內(nèi)的表達(dá)變化

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【摘要】：肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)是肝膽外科臨床實(shí)踐中常見并發(fā)癥。HIRI的發(fā)生不僅增加肝移植術(shù)后的死亡率和發(fā)病率,還導(dǎo)致病人恢復(fù)延遲和愈后較差。研究發(fā)現(xiàn):在缺血再灌注過程中會產(chǎn)生大量ROS(reactive oxygen species:ROS),這些ROS可引起嚴(yán)重微循環(huán)障礙。因此,由ROS引發(fā)的氧化應(yīng)激被認(rèn)為與HIRI的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)。機(jī)體內(nèi)存在多種抗氧化系統(tǒng),其中超氧化物歧化酶(superoxide dismutases,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)是這個防御系統(tǒng)的關(guān)鍵抗氧化酶。它們通過清除代謝反應(yīng)中產(chǎn)生的ROS來保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷。小腸缺血再灌注損傷是小腸移植,循環(huán)性休克和絞窄性腸梗阻等疾病發(fā)生發(fā)展過程中非常常見的臨床問題。研究發(fā)現(xiàn):小腸缺血再灌注損傷會導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)和功能的嚴(yán)重?fù)p害。反之,當(dāng)肝臟缺血再灌注損傷發(fā)生,是否會使小腸結(jié)構(gòu)和功能也產(chǎn)生嚴(yán)重改變?氧化應(yīng)激是否也是導(dǎo)致這種損害的重要因素?抗氧化酶SOD和CAT的表達(dá)如何改變,是否發(fā)揮抗氧化作用?本實(shí)驗首先制造大鼠HIRI模型;再灌注6小時后檢測血清過氧化氫(H_2O_2)水平、丙二醛(MDA)水平;小腸組織內(nèi)H_2O_2水平、MDA水平,CAT和SOD基因及蛋白表達(dá)水平。觀察HIRI發(fā)生后小腸組織形態(tài)學(xué)改變和氧化應(yīng)激水平,探討CAT和SOD清除小腸組織過多ROS的抗氧化作用。目的:觀察肝缺血再灌注損傷模型小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變,小腸組織內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)以及是否遭受過氧化損傷,抗氧化酶CAT和SOD基因及蛋白表達(dá)水平,探討HIRI誘導(dǎo)小腸組織過氧化損傷機(jī)制,抗氧化酶CAT和SOD清除小腸組織過多ROS的抗氧化作用,為尋求預(yù)防和治療HIRI誘發(fā)的小腸組織損傷提供數(shù)據(jù)參考。方法:1大鼠分組、HIRI模型制備及檢測材料處理12只體重200±10g的雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組(Con)和模型組(HIRI)。根據(jù)Kohli等人的操作步驟建立HIRI模型:按照0.5ml/kg的劑量腹腔注射6%水合氯醛麻醉大鼠,分離膽管蒂和肝血管,血管夾阻斷供應(yīng)肝左葉、肝中葉的血管和膽管蒂。30分鐘后再次恢復(fù)肝臟血液循環(huán),建立大鼠HIRI模型。對照組大鼠只分離但不夾閉膽管蒂和血管。肝臟血液供應(yīng)重新恢復(fù)6小時后取血分離血清,用于肝功能指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性、過氧化氫(hydrogen peroxide,H_2O_2)水平、丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平檢測;取大鼠肝臟和小腸中部,部分4%多聚甲醛固定,用于觀察肝臟和小腸組織形態(tài)學(xué)改變(HE染色法),其余部分置于液氮,用于小腸組織內(nèi)H_2O_2含量、MDA含量,抗氧化酶CAT和SOD m RNA水平和蛋白水平的表達(dá)變化。2檢測指標(biāo)及測定方法2.1血清ALT、H_2O_2含量、MDA含量測定全自動生化分析儀測定血清ALT水平;鉬酸比色法測定血清H_2O_2水平;硫代巴比妥酸比色法測定血清MDA水平。2.2大鼠肝臟和小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察采用HE染色法觀察肝臟和小腸組織形態(tài)學(xué)變化。2.3大鼠小腸組織勻漿液MDA含量測定小腸組織勻漿液中MDA含量采用南京建成測定試劑盒檢測(硫代巴比妥酸比色法)。2.4大鼠小腸組織勻漿液H_2O_2含量測定小腸組織勻漿液中H_2O_2含量采用南京建成測定試劑盒檢測(鉬酸比色法)。2.5大鼠小腸組織CAT、SOD基因水平檢測RT-PCR法測定大鼠小腸組織CAT、SOD基因水平。以目的基因CAT和SOD擴(kuò)增條帶灰度值與GAPDH擴(kuò)增條帶灰度值之比代表CAT和SOD m RNA的相對表達(dá)量。2.6大鼠小腸組織CAT、SOD蛋白水平檢測免疫印跡法(Western blot)檢測小腸組織CAT、SOD蛋白水平。雙色紅外線成像系統(tǒng)觀察條帶并分析其灰度值。結(jié)果:1大鼠肝臟、小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化對照組大鼠肝細(xì)胞整齊排列呈條索狀,并放射狀分布在中央靜脈周圍,肝血竇大小平均,無擴(kuò)張充血。而HIRI組肝細(xì)胞表現(xiàn)為受壓萎縮和嚴(yán)重淤血,肝血竇呈明顯的充血擴(kuò)張,且肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見空泡,HE顏色變淺,部分肝細(xì)胞出現(xiàn)水腫,體積增大。但HIRI組和對照組小腸組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯區(qū)別。2血清ALT活性HIRI組大鼠血清ALT活性(87.43±9.06 U/L)明顯高于Con組大鼠血清ALT活性(20.03±5.23U/L)。P0.013血清H_2O_2含量HIRI組大鼠血清H_2O_2含量(23.28±4.19μmol/L)明顯高于Con組大鼠血清中H_2O_2含量(13.52±2.19μmol/L)。P0.014血清MDA含量HIRI組大鼠血清MDA含量(17.54±1.96 umol/L)明顯高于Con組大鼠血清中MDA含量(12.69±2.29 umol/L)。P0.015小腸組織勻漿內(nèi)MDA含量HIRI組大鼠小腸組織勻漿MDA含量(23.97±3.42 mmol/g)明顯高于Con組大鼠小腸組織勻漿MDA含量(15.94±2.24mmol/g),P0.01。6小腸組織勻漿內(nèi)H_2O_2含量HIRI組大鼠小腸組織勻漿H_2O_2含量(36.69±5.98 mmol/g)明顯高于Con組大鼠小腸組織勻漿H_2O_2含量(25.98±4.08 mmol/g),P0.01。7小腸組織CAT和SOD m RNA表達(dá)水平RT-PCR法測定大鼠小腸組織CAT和SOD m RNA表達(dá)水平。HIRI組大鼠小腸組織CAT(0.55±0.09)和SOD(0.85±0.13)m RNA表達(dá)水平明顯高于Con組小腸組織CAT(0.38±0.07)和SOD(0.63±0.11)m RNA表達(dá)水平,P0.01,表明:HIRI組大鼠小腸組織CAT和SOD基因表達(dá)水平增強(qiáng)。8小腸組織CAT和SOD蛋白表達(dá)水平Western blot法測定大鼠小腸組織CAT和SOD蛋白表達(dá)水平。HIRI組大鼠小腸組織CAT(0.59±0.08)和SOD(0.91±0.12)蛋白表達(dá)水平明顯高于Con組小腸組織CAT(0.37±0.06)和SOD(0.67±0.13)蛋白表達(dá)水平,P0.01,表明:HIRI組小腸組織抗氧化關(guān)鍵酶CAT、SOD蛋白水平是明顯增加的。結(jié)論:1小腸組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)在HIRI后雖未出現(xiàn)明顯改變,但此時已發(fā)生氧化應(yīng)激并遭受過氧化損傷。2 HIRI組大鼠小腸組織CAT和SOD基因和蛋白表達(dá)水平均升高,表明:在小腸組織處于高度氧化應(yīng)激狀態(tài)時,CAT和SOD在此過程中可能發(fā)揮了抗氧化應(yīng)激作用。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R657.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 Lian-Yue Guan;Pei-Yao Fu;Pei-Dong Li;Zhuo-Nan Li;Hong-Yu Liu;Min-Gang Xin;Wei Li;;Mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and protective effects of nitric oxide[J];World Journal of Gastrointestinal Surgery;2014年07期

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本文編號：1165517