本文關鍵詞：miRNAlet-7b修飾BMSCs移植對大鼠損傷脊髓結構和功能的影響

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【摘要】：目的:脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是后果非常嚴重的脊柱疾病,它導致神經(jīng)元死亡、功能性運動和感覺喪失,常會引起損傷平面以下軀體感覺與功能的嚴重障礙,喪失生活自理能力。目前,臨床上尚無有效的治療方法。隨著社會的進步和科學家不懈的探索,外源性干細胞移植可能為脊髓損傷的治療帶來曙光,而由于骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs)來源廣泛,分離培養(yǎng)方法簡單,有望成為細胞治療的“種子”。然而在實驗研究中,因為BMSCs移植在宿主體內(nèi)的成活及轉化問題,其進一步應用中無法得到開展。mi RNA廣泛存在于生物體內(nèi),具有調(diào)控真核生物基因表達、個體發(fā)育和細胞周期等作用。研究發(fā)現(xiàn),mi RNAlet-7b可以調(diào)控神經(jīng)干細胞的分化、促進干細胞的自我更新等。但是mi RNAlet-7b修飾的BMSCs移植治療大鼠脊髓損傷的療效,是否比單純的BMSCs移植更好,鮮少有研究報道。本實驗通過Basso Beattie Bresnahan(BBB)評分評估實驗過程大鼠的運動功能,HE染色觀察損傷部位脊髓組織的形態(tài)學變化,免疫組化SP法觀察神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neurun specific etlolase,NSE)、微管相關蛋白(Microtubule associated proteins-1β,MAP-1β)、波形蛋白(Vimentin,VIM)的表達,Rt-PCR檢測脊髓損傷區(qū)NGF m RNA的表達情況,進一步研究mi RNAlet-7b修飾BMSCs移植對大鼠損傷脊髓結構和功能的影響,探討其可能的作用機制。方法:分離培養(yǎng)BMSCs并構建mi RNA-let7b慢病毒載體。按照隨機數(shù)字表法選取60只健康雌性SD大鼠分為3組:對照組、BMSCs組、mi RNA組,每組20只。采用改良Allen’s法建立實驗模型。脊髓損傷后1周,mi RNA組大鼠移植10μL mi RNA-let7b慢病毒載體感染的BMSCs(細胞濃度為10^7/ml),BMSCs組移植等量陰性慢病毒載體轉染的BMSCs,對照組給予損傷部位等量生理鹽水。分別在脊髓損傷后的第1、2、4、8周對大鼠后肢進行BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)評分,評價脊髓損傷后大鼠下肢運動功能的恢復情況。于脊髓損傷后第4周,HE染色觀察損傷部位脊髓組織的形態(tài)學變化,免疫組化法檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、微管相關蛋白(MAP-1β)、波形蛋白(VIM)的表達、Rt-PCR法檢測脊髓損傷區(qū)NGF m RNA的表達情況。實驗數(shù)據(jù)均用SPSS15.0軟件進行統(tǒng)計分析,各組間比較采用單因素方差(ANOVA)分析。如果方差齊,組間比較采用t檢驗;不齊,則采用Tamhane’s T2檢驗,檢驗水準α=0.05。結果:1、BBB評分結果:建模3天前評分均為21分,建模成功后評分均低于8分,結果比較差異無統(tǒng)計學意義;1周后3組大鼠出現(xiàn)雙下肢運動功能不同程度的改善,不同時間點各組大鼠BBB評分由低到高依次為對照組、BMSCs組、mi RNA組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2、HE染色結果:3組大鼠脊髓組織可見結構紊亂充血,神經(jīng)細胞水腫,對照組結構病理學改變嚴重,mi RNA組和BMSCs組較輕。3、免疫組化結果:3組脊髓損傷標本均見NSE、MAP-1β、VIM陽性表達。半定量分析法顯示神經(jīng)特異性標志物NSE、MAP-1β、VIM在mi RNA組表現(xiàn)為陽性細胞的數(shù)目較多、包漿呈棟褐色,陽性表達明顯高于其他各組,差異具有顯著意義。干細胞移植組陽性表達高于對照組(P0.05),組間差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4、PCR結果顯示:脊髓組織中NGF m RNA表達水平由低到高依次為對照組、BMSCs組、mi RNA組,且各組間差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:1、mi RNA Let-7b修飾的BMSCs可促進損傷脊髓NSE、MAP-1β、VIM的表達,并促進脊髓損傷后大鼠神經(jīng)功能的恢復,效果優(yōu)于單純干細胞移植組。2、mi RNA let-7b修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞可改善大鼠損傷脊髓的病理改變。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R651.2

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