本文關鍵詞：小腸粘膜下層—蠶絲復合支架重建膝關節(jié)前交叉韌帶的初步研究

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【摘要】：1.研究背景前交叉韌帶(anterior cruciate ligament,ACL)是維持膝關節(jié)穩(wěn)定性重要的結(jié)構,損傷后自我愈合能力較差,臨床上主要通過手術重建恢復膝關節(jié)的穩(wěn)定性。臨床ACL重建術常使用的移植物包括自體移植物、同種異體移植物以及人工韌帶。自體移植物是臨床首選,尤其是髕韌帶中部1/3的骨-臏腱-骨移植物被認為是臨床重建的“金標準”；但自體移植物取材有限,并且術后往往發(fā)生供區(qū)疼痛、愈合時間長、甚至髕腱斷裂等供區(qū)并發(fā)癥。同種異體移植物是臨床備選材料,但應用時也存在疾病傳播、術后感染,宿主的免疫排斥反應等風險,而且來源有限。人工韌帶,來源廣泛,力學性能卓越,但合成材料無生物活性,無法與宿主完全融合,長期應用,支架材料會發(fā)生疲勞斷裂。長期療效不穩(wěn)定。這些因素都阻礙了自體和同種異體移植物以及人工韌帶在臨床的廣泛應用。因此,亟待尋找一種來源廣泛、生物相容性好,免疫原性低、與自體ACL力學相匹配的支架材料。蠶絲是一種天然生物材料。其彈性和強度的優(yōu)異結(jié)合,良好的生物相容性,緩慢的生物降解性,低免疫原性以及易于編織等特性使蠶絲纖維成為較理想的韌帶組織工程支架材料。編織的蠶絲支架及蠶絲-蠶絲海綿,蠶絲-Ⅰ型膠原等復合支架近些年被廣泛研究,動物體內(nèi)重建ACL后均達到了較好的重建效果。然而目前這些研究通常以充當細胞外基質(zhì)主要成分的膠原作為蠶絲支架的修飾物,并未涉及對組織細胞有重要調(diào)節(jié)作用的細胞因子,而且通過促進支架材料早期血管化來提高重建效果的方法也少有研究。小腸黏膜下層(small intestinal submucosa, SIS)是目前應用最廣泛的細胞外基質(zhì)材料之一,其主要成分為Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原,以及少量的多糖類物質(zhì)。SIS富含多種生長因子：如血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-β)等,這些因子在SIS經(jīng)過處理后仍得以保留,并保持了其生物活性。SIS體內(nèi)移植后被證實能迅速誘導細胞生長遷移,刺激血管生成,使修復部位早期血管化,在心肌梗死修復和組織工程皮膚,食管,軟骨等領域被廣泛應用。2.研究目的在組織修復重建過程中,血管可以起到提供氧氣和營養(yǎng)、運輸代謝產(chǎn)物的作用,因此移植物的早期血管化能力對組織修復意義重大。本研究欲采用富含細胞活性生長因子和Ⅰ型膠原并且體內(nèi)移植后具有促血管化能力的SIS與力學性能優(yōu)異的蠶絲支架結(jié)合,設計制備SIS-蠶絲復合支架,并評價復合支架的力學性能,生物相容性,以及體內(nèi)移植后是否具有促進移植物早期血管化進而提高重建效果的潛能。3.研究方法3.1蠶絲支架與SIS-蠶絲復合支架制備將天然蠶絲通過0.02m NaHCO3溶液處理,完全脫去絲膠。參考文獻,采用扭轉(zhuǎn)纜繩式設計,通過方程式模型模擬兔自體ACL的力學特性,用計算機蠶絲編織機編織符合兔自體ACL力學特性的蠶絲支架。將膜狀SIS呈圓筒狀包繞在蠶絲支架外圍構建SIS-蠶絲復合支架。3.2支架力學性能評價及表面形貌觀察通過生物力學測試儀評價支架的力學性能,通過掃描電鏡(SEM)觀察支架材料的表面形貌特征。3.3支架材料細胞相容性評價通過活死細胞染色法,觀察支架材料對骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)的影響。通過CCK-8法繪制生長曲線,評價支架材料浸提液對細胞生長的影響。3.4支架組織相容性評價及異位移植早期血管化能力評價30只6周齡SD大鼠隨機分為兩組,蠶絲支架組(S組)與復合支架組(SS組),分別將兩組支架材料移植大鼠皮下,2W、4W、8W取材行HE染色觀察,通過計數(shù)炎性細胞評價組織相容性,通過統(tǒng)計血管數(shù)目和觀察支架新生血管的位置分布評價支架的促血管化能力。3.5兩支架對關節(jié)液滲入脛骨隧道影響的評價20只新西蘭大白兔平均分為兩組,S組與SS組。行雙膝前交叉韌帶重建,術中脛骨隧道開窗,5ml 10%NaCl和墨水溶液分別行關節(jié)腔內(nèi)注射,不同時間點測量骨窗內(nèi)移植腱的電阻值并記錄骨窗處墨水滲出時間。3.6重建術后支架移植物表面血管化評價用體式顯微鏡觀察重建術后4W,8W,12W韌帶移植物新鮮標本在骨遂道內(nèi)口和移植物中間段的血管分布情況,評價支架關節(jié)內(nèi)移植后表面早期血管化情況。3.7術后支架移植物韌帶化評價重建術后4W,8W,12W,每組處死3只實驗動物,取移植物標本行HE和Masson染色觀察,評價支架關節(jié)內(nèi)移植后韌帶化情況。3.8術后腱骨界面愈合的評價術后4W,8W,12W,每組處死3只實驗動物,取股骨-韌帶移植物-脛骨復合體標本,通過骨遂道m(xù)icro-CT掃描觀察,評估骨遂道內(nèi)鈣化物質(zhì)形成狀況。掃描完成后標本再通過固定,脫鈣處理,獲取骨與韌帶連接處,通過腱骨界面處HE組織學染色觀察,評價腱骨愈合情況。3.9術后移植物復合體力學測試術后4W,8W,12W,取股骨-韌帶移植物-脛骨復合體標本,通過生物力學測試機,測試復合體的力學性能,綜合評價術后移植物復合體的整體力學性能。4.結(jié)果4.1支架材料大體觀察處理后獲得的SIS為白色富有彈性的膜狀材料。蠶絲支架為多股脫膠后蠶絲螺旋編織而成。復合支架內(nèi)部為螺旋蠶絲束,外圍由SIS呈圓筒狀包繞。4.2支架力學性能評價及掃描電鏡觀察蠶絲支架與復合支架最大載荷分別為138.62±11.41N,137.05±16.95N,剛度分別為(24.65±2.62)、(24.21±2.39)N·mm-1,形變量分別為9.40%、10.67%,差異比較均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。復合支架與兔白體韌帶的最大載荷匹配,分別為137.05±16.95 N與135.27±20.25 N,(P0.05),但剛度有差別,分別為24.21±2.39 N/mm與49±15.02 N/mm,(P.0.05)。SEM示未處理的蠶絲表面凹凸不平,覆蓋有大量絲膠。脫膠處理后蠶絲表面光滑,基本無絲膠附著。SIS表面膠原纖維縱橫交錯排列,膠原間形成大小不一的孔洞。構建的復合支架中間為蠶絲支架,表面由三層膜狀SIS包繞而成。4.3支架材料細胞相容性評價活死細胞染色示兩種支架材料上細胞形態(tài)良好,外形輪廓清晰。其中復合支架上BMSCs申展性更好,并分泌大量細胞外基質(zhì)。細胞增殖曲線示3組A值均隨培養(yǎng)時間延長而升高,呈時間依賴性。各時間點A、B、C 3組A值比較差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.4兩支架對關節(jié)液滲入脛骨隧道影響的評價關節(jié)腔10%NaCl灌注后SS組電阻值開始下降的時間點明顯晚于S組(P0.05),SS組電阻值擬合曲線的斜率明顯小于S組,差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.403,P=0.016)。關節(jié)腔內(nèi)墨水灌注后,SS組墨水未滲出時間及流注時間均較S組明顯增長,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.5支架組織相容性和體內(nèi)異位移植后促血管化能力評價皮下埋植標本HE染色示,術后兩組支架內(nèi)均出現(xiàn)炎癥細胞浸潤,隨時間延長炎癥反應明顯減緩,其中各時間點SS組炎性細胞數(shù)明顯少于S組(P0.05)。術后2周SS組支架外緣的SIS開始降解,降解處可見較多新生血管,新生血管管腔小,密度大。術后4周SS組中SIS大量降解,支架中間部分逐漸出現(xiàn)較多新生血管；術后8周血管遍布支架表面和內(nèi)部,血管變?yōu)楣芮淮蟮某墒煅�。而S組術后各時間點均未見明顯新生血管。術后各時間點兩組新生血管數(shù)比較差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.6重建術后支架移植物表面血管化評價由體式顯微鏡觀察,術后4周時SS組移植物表面被明顯滑膜組織覆蓋,靠近骨隧道內(nèi)口處可見滑膜表面明顯的毛細血管網(wǎng)形成；術后8周時見滑膜內(nèi)有較成熟的血管向移植物的中段延伸；術后12周時均可見管腔粗大的血管貫穿韌帶移植物表面。S組在術后4周支架表面未見有明顯血管出現(xiàn)；術后8周時移植物表面僅有少量滑膜增生；術后12周時滑膜組織增多,滑膜表面僅有小血管出現(xiàn)。4.7重建術后支架移植物韌帶化評價HE染色顯示：S組在術后4周時有大量炎性細胞浸潤,表面未見明顯滑膜組織；術后8周,蠶絲纖維表面有少量滑膜樣組織；術后12周時移植物結(jié)構緊湊,表面滑膜組織增厚,仍未見明顯血管出現(xiàn)。SS組術后4周,移植物結(jié)構緊湊,有大量細胞浸潤。有三層結(jié)構：滑膜組織,未降解的層狀SIS,蠶絲纖維結(jié)構。術后8周,三層結(jié)構變?yōu)閮蓪咏Y(jié)構,外層滑膜組織明顯增厚,滑膜中間彌漫大量新生血管,里層蠶絲纖維致密。術后12周,移植物層次界限模糊,結(jié)構致密條理,類似自體韌帶樣組織。Masson染色示：S組在術后4周時,僅見大量蠶絲纖維,未見明顯的膠原纖維；8周時支架中出現(xiàn)稀疏雜亂的膠原纖維；12周時膠原纖維密度增大,但分散、排列不規(guī)整。SS組在術后4周時,支架表面有較厚的膠原層,支架內(nèi)部出現(xiàn)稀疏雜亂的膠原纖維；術后8周時,支架內(nèi)部出現(xiàn)濃密、排列較規(guī)整的膠原纖維,膠原纖維直徑較�。盒g后12周時,支架的層次分界變模糊,內(nèi)部彌漫大量較成熟且分布致密、排列規(guī)則的膠原纖維。4.8術后腱骨界面愈合評價4.8.1組織學評價HE染色示,S組在術后4周時移植物與骨隧道壁之間連接較少；術后8周時界面由肉芽組織填充；術后12周時界面組織中出現(xiàn)致密的纖維連接,沿界面垂直排列,類似sharpey樣纖維。SS組在術后4周時,移植物與骨隧道壁之間由致密的肉芽組織填充,中間彌漫大量細胞和新生毛細血管；術后8周時界面中出現(xiàn)濃厚致密的纖維連接,纖維排列規(guī)則,沿界面垂直方向排列；術后12周時腱骨界面層次模糊,骨隧道壁出現(xiàn)大量成骨細胞,界面中出現(xiàn)軟骨細胞,類似不成熟的腱骨軟骨過渡區(qū)。4.8.2 micro-CT掃描結(jié)果通過分析可知,在重建4周后,SS組與S組骨隧道內(nèi)均未見明顯鈣化組織沉積,在重建后12周,兩組骨隧道半徑未擴大,但骨隧道內(nèi)仍然未見明顯鈣化信號。術后4周與12周,骨隧道面積沒有明顯增大。4.9術后移植物力學評價SS組與S組樣本損毀模式差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。術后4周時,SS組與S組的最大載荷和剛度分別為(40±12.03)、(30±7.91)N和(6.90±1.14)、(5.98±0.81)N/mm,最大載荷與剛度兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。術后8周時,SS組的最大載荷與剛度均強于S組,最大載荷分別為(45.20±8.44)、(20.20±4.76)N,剛度分別為(5.02±0.84)、(3.36±0.96)N/mm,兩組間差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。術后12周時,SS組的最大載荷與剛度均強于S組,最大載荷分別為(58±5.70)、(30.6±6.84)N,剛度為(8.12±0.60)、(3.96±0.86)N/mm,兩組間差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。5.0結(jié)論本研究通過促血管化思路設計制備了SIS-蠶絲復合支架。復合支架力學性能優(yōu)異,細胞和組織相容性好,體內(nèi)異位移植能早期血管化,并對重建初期脛骨隧道關節(jié)液滲入有較好的減緩作用。支架關節(jié)內(nèi)移植后,復合支架早期實現(xiàn)了血管化,韌帶化效果好,腱骨連接界面出現(xiàn)軟骨細胞過渡區(qū),并且整體力學性能明顯優(yōu)于蠶絲支架。復合支架短期重建效果較好,有望成為一種良好的前交叉韌帶重建支架。
【關鍵詞】：前交叉韌帶重建 小腸粘膜下層 蠶絲 復合支架 血管化 腱骨愈合
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R687.4
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-22
• 第一部分 復合支架的體外構建及性能評價22-43
• 1.1 前言22-23
• 1.2 材料與方法23-31
• 1.3 結(jié)果31-39
• 1.4 討論39-42
• 1.5 結(jié)論42-43
• 第二部分 支架關節(jié)內(nèi)重建術后效果評價43-68
• 2.1 前言43-44
• 2.2 實驗材料及儀器44-45
• 2.3 實驗方法及觀察指標45-49
• 2.4 結(jié)果49-61
• 2.5 討論61-67
• 2.6 結(jié)論67-68
• 第三部分 研究存在的不足68-70
• 1、術后觀測時間短68
• 2、未從分子層面進一步探究支架的修復機制68-70
• 第四部分 全文總結(jié)70-71
• 參考文獻71-78
• 攻讀學位期間成果78-79
• 附錄79-80
• 致謝80-82

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