本文關(guān)鍵詞：MicroRNA-214在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中作用的研究

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【摘要】：研究背景：骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是臨床最普遍、最常見的關(guān)節(jié)退行性疾病之一,常常受累于膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié),其中膝關(guān)節(jié)受累最常見。OA可能是由各種因素引發(fā)的全關(guān)節(jié)性疾病,其中關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的變化尤為明顯和重要,隨著其內(nèi)部任何結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)的改變,都會影響全關(guān)節(jié)的內(nèi)部平衡穩(wěn)態(tài),從而導致疾病的發(fā)生。MicroRNAs (miRNAs, miR)已被發(fā)現(xiàn)在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用。本研究探討不同分級的骨性關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨中miR-214的表達、分子基因水平等特點,研究miR-214的表達在OA發(fā)生和發(fā)展中的作用。方法：(1)收集從2013年10月—2014年12月的行人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后的原發(fā)性OA患者的脛骨平臺40例為實驗標本,觀察標本脛骨平臺大體觀,按照膝關(guān)節(jié)OA的Outerbridge分級標準進行肉眼分級后,檢測各組軟骨及軟骨下骨中miR-214的表達水平。(2)取3天齡健康C57乳鼠20只,提取膝關(guān)節(jié)軟骨細胞后,對其進行IL-1β和antagomir-214的誘導培養(yǎng),分別檢測代表軟骨細胞功能相關(guān)基因的表達情況及細胞外基質(zhì)的分泌情況。(3)40只C57隨機分成實驗組(ACLT手術(shù)組和ACLT聯(lián)合antagomir-214組,每組10只)和對照組(假手術(shù)組和假手術(shù)聯(lián)合antagomir-214組，每組10只)。取膝關(guān)節(jié)標本進行大體觀察、組織學染色、免疫組化染色、實時熒光定量PCR等檢測。(4)2月齡新西蘭大白兔分離培養(yǎng)軟骨細胞,與去細胞軟骨基質(zhì)支架制備細胞-支架復合物。對照組單純細胞支架復合靜態(tài)培養(yǎng)1d,實驗組于Instron生物反應器中培養(yǎng),加以力學刺激(力學加載參數(shù)為3 h/d,1 Hz,壓縮量為10%)7,14,21,28 d。結(jié)果：(1)檢測不同Outbridge級別OA樣本后,軟骨中,所有樣本均有miR-214表達,各組表達水平呈逐漸上升趨勢(P0.05)。軟骨下骨中,miR-214的表達水平在Ⅲ級組明顯高于Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅳ級組(P0.05)。(2)軟骨細胞經(jīng)不同誘導培養(yǎng)后,IL-1p組染色顯示隨著IL-1p誘導時間的延長,基質(zhì)染色陽性率逐漸降低。IL-1β+antagomir-214組基質(zhì)陽性染色率遞增。免疫組化染色顯示IL-1β組隨著誘導時間的延長,COL-1、COL-X、MMP-13陽性顯色逐漸增加，COL-II陽性顯色逐漸降低。IL-1β+antagomir-214組, COL-I、COL-X、MMP-13陽性染色逐漸降低。RT-PCR結(jié)果顯示IL-1β組COL-II的表達水平逐漸降低；而COL-I、COL-X、MMP-13的表達均逐漸升高,并且miR-214的表達也逐漸升高。IL-1β+antagomir-214組，COL-II的表達水平逐漸升高;COL-I、COL-X、MMP-13的表達水平逐漸降低。(3)動物模型實驗結(jié)果影像學顯示OA模型小鼠膝關(guān)節(jié)呈骨關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)。miR-214的表達水平隨OA模型建立的時間逐漸升高(P0.05)。而關(guān)節(jié)腔注射antagomir-214后，病變對比未注射antagomir-214,骨質(zhì)增生相對減少,關(guān)節(jié)退變程度較低。組織學染色顯示動物模型建立后,軟骨細胞逐漸增生肥大,細胞外基質(zhì)染色逐漸減少。而ACLT+antagomir-214組中軟骨退變較ACLT組減少,細胞外基質(zhì)保留較多。免疫組化結(jié)果對照組軟骨基質(zhì)中Ⅱ型膠原陽性著色均勻，，而ACLT組軟骨基質(zhì)中Ⅱ型膠原陽性著色逐漸減少,基質(zhì)丟失較多。ACLT+antagomir-214組中Ⅱ型膠原陽性染色相對較高,基質(zhì)丟失較少。(4)隨著培養(yǎng)時間的延長,實驗組細胞-支架復合物彈性模量顯著高于對照組(P0.05)。實驗組切片番紅“O”染色見細胞-支架復合物的細胞外基質(zhì)中有大量蛋白聚糖形成,隨力學刺激時間延長而逐漸增加。RT-PCR檢測示,實驗組Ⅰ,Ⅱ型膠原表達均高于對照組(P0.05),實驗組中力學刺激21 d時Ⅱ型膠原表達最高(P0.05)； Ⅰ型膠原在力學刺激28 d表達最高(P0.05)。隨著力學刺激時間延長,miR-214表達在加載21天后逐漸升高。結(jié)論：(1)miR-214的表達水平與骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)展的嚴重程度密切相關(guān)。(2)miR-214拮抗劑(antagomir-214)對IL-1p誘導的軟骨細胞功能衰退的過程可能有抑制作用。miR-214拮抗劑對減緩OA的進展可能有顯著作用。(3)本實驗結(jié)果為骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生機理提供了新的線索,為將來的核酸藥物治療骨關(guān)節(jié)炎進展的發(fā)展提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：骨關(guān)節(jié)炎 MicroRNA-214 關(guān)節(jié)軟骨 IL-1β antagomir-214
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R684.3
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 參考文獻12-14
• 第一部分 骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨中MicroRNA-214表達水平的研究14-48
• 實驗一 骨關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨中MicroRNA-214的表達水平14-22
• 引言14
• 材料與方法14-18
• 結(jié)果18-19
• 討論19-20
• 結(jié)論20
• 參考文獻20-22
• 實驗二 miR-214對小鼠軟骨細胞的作用機制的研究22-37
• 引言22
• 材料與方法22-27
• 結(jié)果27-33
• 討論33-34
• 結(jié)論34-35
• 參考文獻35-37
• 實驗三 C57小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型中miR-214的作用的研究37-48
• 引言37
• 材料與方法37-40
• 結(jié)果40-44
• 討論44-46
• 結(jié)論46
• 參考文獻46-48
• 第二部分 miR-214在生物反應器制備的組織工程軟骨中的表達48-60
• 引言48
• 材料與方法48-52
• 結(jié)果52-54
• 討論54-57
• 結(jié)果57
• 參考文獻57-60
• 文獻綜述60-90
• 參考文獻78-90
• 縮略詞表90-92
• 攻讀學位期間發(fā)表文章情況92-94
• 致謝94

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本文編號：1104097