本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與軟骨細(xì)胞聚集共培養(yǎng)修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的研究

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【摘要】：一、體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與軟骨細(xì)胞聚集共培養(yǎng)體系的建立目的:探索骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs)與軟骨細(xì)胞(Articular Chontrocytes,ACs)在體外通過(guò)離心聚集構(gòu)建的共培養(yǎng)體系下,其分化為ACs的能力。方法:4周齡新西蘭大白兔幼兔在無(wú)菌環(huán)境下,取其骨髓和軟骨,通過(guò)分離、貼壁培養(yǎng)、傳代BMSCs和ACs。利用流式細(xì)胞儀測(cè)CD44、CD31對(duì)BMSCs進(jìn)行鑒定,利用阿利新藍(lán)染色、番紅花O-亮綠染色及Ⅱ型膠原染色免疫組化染色對(duì)ACs進(jìn)行鑒定。ACs和BMSCs按1:3的比例混合為CO組,細(xì)胞總數(shù)為4×107,在500g離心力下離心5分鐘,聚集共培養(yǎng)于15ml離心管內(nèi)。另取等量的ACs為AC組,以上述方法培養(yǎng)于離心管內(nèi)作對(duì)比研究。隔日換液,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,利用阿利新藍(lán)比色法定量檢測(cè)細(xì)胞糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)含量,酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)定量檢測(cè)Ⅱ型膠原含量。結(jié)果:經(jīng)鑒定獲取的BMSCs CD44(+)、CD31(-);ACs阿利新藍(lán)、番紅花O-亮綠及Ⅱ型膠原染色免疫組化染色均陽(yáng)性。利用貼壁培養(yǎng)傳代可獲取滿意純度BMSCs和ACs。CO組與AC組離心管內(nèi)聚集共培養(yǎng)三周,檢測(cè)分泌的GAG含量和Ⅱ型膠原含量無(wú)差異(P0.05);至第四周末檢測(cè)分泌的GAG含量和Ⅱ型膠原含量有差異(P0.05)。結(jié)論:BMSCs和ACs通過(guò)離心管內(nèi)聚集共培養(yǎng)可誘導(dǎo)BMSCs分化為ACs。二、體內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與軟骨細(xì)胞聚集修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損目的:研究利用bmscs和acs離心管內(nèi)聚集共培養(yǎng)構(gòu)建無(wú)支架細(xì)胞團(tuán)修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的能力。比較細(xì)胞共培養(yǎng)體系與acs、bmscs及空白體內(nèi)修復(fù)骨軟骨缺損的能力。方法:構(gòu)建兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損模型,以手搖鉆在兔膝關(guān)節(jié)雙側(cè)股骨髁間凹制造直徑4mm的骨軟骨缺損。將acs和bmscs分別染以細(xì)胞膜熒光染色劑pkh-67和pkh-26后,以1:3的比例混合,細(xì)胞總數(shù)為4×107,于15ml離心管內(nèi)500g離心5分鐘成團(tuán)。再分別以等量bmscs和acs以上述方式處理制成的細(xì)胞團(tuán)。用這三組細(xì)胞團(tuán)分別修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損。另留取一組關(guān)節(jié)缺損不修復(fù),作為空白組。共四個(gè)處理組:共培養(yǎng)修復(fù)組(co組)、acs修復(fù)組(ac組)、bmscs修復(fù)組(bmsc組)、空白組(empty組)。每個(gè)組樣本量18只兔36膝。在兔體內(nèi)修復(fù)關(guān)節(jié)骨軟骨缺損后分別在4周、8周、12周三個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取每組12個(gè)樣本,取出關(guān)節(jié)后,按照cook's評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行關(guān)節(jié)修復(fù)情況的大體評(píng)價(jià)。各樣本取樣切片,進(jìn)行組織細(xì)胞學(xué)觀察(冰凍切片觀察細(xì)胞熒光、he染色觀察修復(fù)組織細(xì)胞形態(tài)、番紅花o染色觀察軟骨細(xì)胞分泌gag的能力、Ⅱ型膠原免疫組化染色觀察acs分泌Ⅱ型膠原的能力),并按wakitani's組織學(xué)評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)分。結(jié)果:各組兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損得到不同程度修復(fù),co組和ac組修復(fù)外觀優(yōu)于bmsc組和empty組,cook's評(píng)分結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),co組與ac組的cook's評(píng)分結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。12周冰凍切片熒光顯示bmscs和acs共同參與了骨軟骨的修復(fù),但單純bmsc組中外源bmscs參與修復(fù)骨軟骨的能力有限。各時(shí)間點(diǎn)co組和ac組的骨軟骨缺損由透明軟骨細(xì)胞或纖維軟骨細(xì)胞修復(fù),軟骨細(xì)胞外基質(zhì)分泌豐富;bmsc組和empty組的骨軟骨缺損由纖維組織修復(fù),缺乏軟骨細(xì)胞外基質(zhì)。co組和ac組的wakitani's組織學(xué)評(píng)分與bmsc組和empty組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。co組與ac組的wakitani's組織學(xué)評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:1、可利用離心管內(nèi)聚集共培養(yǎng)技術(shù)制作無(wú)支架細(xì)胞團(tuán)修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損。2、體內(nèi)BMSCs可被ACs誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞并參與修復(fù)骨軟骨缺損,BMSCs修復(fù)骨軟骨的能力有限。3、BMSCs和ACs聚集成團(tuán)共培養(yǎng)體系無(wú)支架修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的能力不弱于全軟骨細(xì)胞團(tuán),可替代全軟骨以節(jié)約軟骨細(xì)胞的使用。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 軟骨細(xì)胞 共培養(yǎng) 無(wú)支架 組織工程軟骨
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R687.4;R318.08
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 前言11-13
• 材料和儀器準(zhǔn)備13-15
• 第一部分 體外軟骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞離心管內(nèi)聚集共培養(yǎng)15-27
• 一、實(shí)驗(yàn)方法15-20
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果20-24
• 三、討 論24-26
• 四、結(jié) 論26-27
• 第二部分 體內(nèi)軟骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞離心管內(nèi)聚集共培養(yǎng)修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損27-49
• 一、實(shí)驗(yàn)方法27-33
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-45
• 三、討 論45-48
• 四、結(jié) 論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-54
• 綜述54-69
• 參考文獻(xiàn)62-69
• 中英文縮寫詞表69-70
• 攻讀學(xué)位期間公開(kāi)發(fā)表的論文70-71
• 致謝71-72

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中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 服部高子 ,李軍;干細(xì)胞移植修復(fù)軟骨缺損的研究[J];日本醫(yī)學(xué)介紹;2003年02期

2 張積禮;武U，

本文編號(hào)：1101101