本文關(guān)鍵詞：EC-SOD在大鼠肝缺血再灌注損傷模型心肌內(nèi)的表達(dá)變化

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【摘要】：肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)是肝臟外科手術(shù)如肝臟移植、肝部分切除等臨床治療過程中經(jīng)常會(huì)發(fā)生的并發(fā)癥,這也是引發(fā)患者肝移植失敗,肝功能衰竭及愈后較差的關(guān)鍵因素。眾多研究已表明:暫時(shí)性阻斷肝臟血流供應(yīng),然后再重新恢復(fù)其灌注時(shí)可誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生,產(chǎn)生大量高活性的活性氧族(reactive oxygen species:ROS),ROS對(duì)肝臟組織細(xì)胞引發(fā)的過氧化損傷是導(dǎo)致HIRI的主要機(jī)制。ROS的成員主要有超氧陰離子(O~(2-).)、過氧化氫(H_2O_2)以及羥自由基(OH.)等。ROS的生物化學(xué)性質(zhì)極其活潑,能與胞內(nèi)和胞膜上的一些重要蛋白(如結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白)和脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng),從而破壞胞膜的結(jié)構(gòu),損害細(xì)胞功能,甚至引起細(xì)胞和組織的死亡。肝臟不僅是糖類、蛋白和脂類等物質(zhì)的重要代謝場(chǎng)所,還是重要的分泌、排泄和生物轉(zhuǎn)化器官。因此,當(dāng)其結(jié)構(gòu)和功能受到損害時(shí)必然會(huì)引起機(jī)體內(nèi)其他重要臟器的結(jié)構(gòu)和功能異常。心臟是機(jī)體內(nèi)氧氣消耗量大、對(duì)缺血缺氧反應(yīng)極為敏感的臟器。當(dāng)暫時(shí)阻斷肝臟血供再重新恢復(fù)其灌注,肝組織細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激損傷時(shí),心臟是否也會(huì)遭受過氧化損傷?有待研究。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutases,SOD)是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶之一,它能催化O~(2-)氧化生成氧和H_2O_2。因此,SOD是清除O~(2-)的重要酶蛋白,在機(jī)體內(nèi)的抗過氧化過程具有重要作用。哺乳動(dòng)物體內(nèi)共有三種SOD亞型:在線粒體內(nèi)以錳作為輔基的錳-超氧化物歧化酶(Mn-SOD),在細(xì)胞胞漿中以銅和鋅作為輔基的銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)。細(xì)胞外超氧化物歧化酶(extracellular SOD,EC-SOD)是機(jī)體內(nèi)唯一位于細(xì)胞外的SOD亞型,它依靠自身的肝素結(jié)合域(heparin-binding domain,HBD)能與細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞表面結(jié)合。以往眾多的抗氧化功能研究主要集中于Cu/Zn-SOD和Mn-SOD。但最近的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn):細(xì)胞外的EC-SOD在機(jī)體內(nèi)的抗氧化應(yīng)激和抗炎反應(yīng)中可能發(fā)揮了更重要的作用。研究顯示:心肌組織內(nèi)EC-SOD含量降低的病人,其發(fā)生高血壓和缺血性心臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。EC-SOD與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合能力下降也會(huì)增加心血管和缺血性心臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)。此外,心臟衰竭患者的EC-SOD表達(dá)是降低的。這表明EC-SOD可能對(duì)維持心肌功能具有重要作用。EC-SOD在肝臟缺血再灌注損傷模型心肌組織內(nèi)的表達(dá)如何變化,是否在此過程中發(fā)揮了抗氧化作用,未見報(bào)道。本研究通過阻斷大鼠肝左葉、肝中葉的血管和膽管蒂再重新恢復(fù)其灌注的方法制造大鼠HIRI模型,然后觀察大鼠心肌組織內(nèi)MDA含量、H_2O_2含量、血清LDH水平,以及EC-SOD的mRNA和蛋白表達(dá)水平。探討肝臟缺血再灌注損傷發(fā)生后心肌組織內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)以及EC-SOD的抗氧化作用。目的:觀察大鼠肝缺血再灌注損傷模型心肌組織內(nèi)的MDA和H_2O_2含量,抗氧化酶EC-SOD的mRNA和蛋白表達(dá)水平的改變,探討肝缺血再灌注損傷發(fā)生后心肌組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)及EC-SOD在此過程中可能發(fā)揮的抗氧化作用。方法:1大鼠肝缺血再灌注損傷模型的制備及取材選用12只雄性健康Wistar大鼠,體重190-210g,于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購得。隨機(jī)分為肝缺血再灌注損傷組(HIRI)6只,對(duì)照組(Con)6只。6%水合氯醛(自配)按0.5ml/kg計(jì)量,對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射,將其麻醉。參照Kohli等人的方法,用玻璃針輕柔分離肝血管和膽管,游離出通往肝中葉和肝左葉的血管和膽管蒂,用無損傷血管夾將其夾閉。30分鐘后移開血管夾,恢復(fù)肝中葉和肝左葉的血液供應(yīng),制造肝實(shí)質(zhì)70%的肝缺血再灌注損傷模型。對(duì)照組大鼠麻醉后,只游離肝中葉和肝左葉的血管和膽管蒂,30分鐘后關(guān)腹。肝臟恢復(fù)血供6小時(shí)后再次將其麻醉,收集大鼠血液,用于ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)和LDH(血清乳酸脫氫酶)的活性測(cè)定;取大鼠肝臟,將其置于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定,用HE染色法觀察大鼠肝組織的形態(tài)學(xué)改變;取大鼠心臟,用冰生理鹽水洗去心臟表面及心腔內(nèi)的余血,并將心臟置于液氮中用于EC-SOD的mRNA水平和蛋白水平測(cè)定,以及MDA含量和H_2O_2含量測(cè)定。2測(cè)定指標(biāo)及方法2.1 HE染色法觀察大鼠肝臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)肝組織經(jīng)常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明,石蠟包埋后,進(jìn)行切片,厚度約5μm,用蘇木精伊紅染色,在日產(chǎn)Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肝臟組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。2.2大鼠血清中ALT活性的測(cè)定大鼠血液未經(jīng)抗凝處理,3000rpm離心10min后分離血清,用血清ALT全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定其含量。2.3大鼠血清中LDH活性的測(cè)定大鼠血液LDH活性的測(cè)定,按照試劑盒的操作說明,采用LD-L速率法測(cè)定。2.4大鼠心肌勻漿的制備以及MDA含量的測(cè)定從-80℃冰箱中取出肝缺血再灌注損傷組及對(duì)照組大鼠的心肌組織,按照10mg/100μl的比例,加入4度勻漿緩沖液(PH7.4,磷酸鉀緩沖液50mmol/L,PMSF1mmol/L,鹽酸苯甲脒1mmol/L,Na Cl0.5mol/L,0.1%Tween-20,β-巰基乙醇5mmol/L,EDTANa31mmol/L),冰浴中勻漿,4℃勻漿液4000rpm離心20分鐘,取上清即制成10%心組織勻漿,心組織勻漿內(nèi)MDA含量經(jīng)南京建成丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒測(cè)定。2.5大鼠心肌組織H_2O_2含量測(cè)定將從-70℃冰箱中取出的心肌組織按照10mg/100μl加入預(yù)冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液,PH7.4,1mmol/L鹽酸苯甲脒,1mmol/L PMSF,0.1%Tween-20,0.5mol/L Na Cl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巰基乙醇),冰浴中勻漿,勻漿液4000rpm 4℃離心20min,取上清即制成10%心肌組織勻漿。心肌組織勻漿內(nèi)H_2O_2含量采用鉬酸比色法測(cè)定,以每克樣本蛋白所含的過氧化氫的量(mmol/g pro)表示。2.6大鼠心肌組織EC-SOD mRNA水平測(cè)定用TRIzol法提取大鼠心肌組織總RNA。將3μg RNA反轉(zhuǎn)錄生成c DNA。用GAPDH作為內(nèi)參照,進(jìn)行RT-PCR。用EC-SOD擴(kuò)增產(chǎn)物的灰度值與GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物的灰度值相比,表示目的基因EC-SOD的相對(duì)表達(dá)量。2.7大鼠心肌組織EC-SOD蛋白水平測(cè)定采用Western blotting的方法測(cè)定大鼠心肌組織內(nèi)EC-SOD蛋白的相對(duì)表達(dá)量。將-80度冷凍的大鼠心肌組織制成勻漿液,離心后取上清。采用改良的Lowry法進(jìn)行蛋白總量測(cè)定。大鼠心肌組織的蛋白上樣量為62ug。經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉處理后,在PVDF膜上加入兔抗EC-SOD一抗,室溫靜置過夜。洗膜后,再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG二抗。按照發(fā)光試劑操作說明進(jìn)行顯影、定影、晾干。后對(duì)膠片進(jìn)行掃描處理,并做圖像分析,以EC-SOD條帶的灰度值與內(nèi)參照GAPDH灰度值之比表示EC-SOD的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果:1大鼠肝臟形態(tài)學(xué)改變?cè)诠鈱W(xué)顯微鏡下可見肝缺血再灌注損傷組大鼠的肝組織淤血嚴(yán)重,肝細(xì)胞受壓萎縮,肝血竇擴(kuò)張充血明顯,肝細(xì)胞胞漿內(nèi)有空泡出現(xiàn)并且染色變淺,有部分肝細(xì)胞水腫,染色變淺,體積增大。對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞排列整齊成條索狀,圍繞中央靜脈排列成放射狀,肝血竇無擴(kuò)張充血大小均勻。2血清ALT水平Con組大鼠血清中ALT為20.03±5.23U/L,而HIRI組血清ALT為87.43±9.06 U/L。HIRI組大鼠血清ALT水平明顯高于Con組(P0.01)。3血清LDH水平Con組大鼠血清中LDH為481.5±67.15U/L,而HIRI組血清LDH為658.83±94.15 U/L。HIRI組大鼠血清LDH水平明顯高于Con組(P0.01)4心肌組織內(nèi)MDA的含量Con組大鼠心肌組織MDA的含量為9.24±1.72mmol/g,而HIRI組MDA含量為12.73±1.84 mmol/g。HIRI組大鼠心肌組織MDA的含量明顯高于Con組(P0.01)5心肌組織內(nèi)H_2O_2含量Con組大鼠心肌組織內(nèi)H_2O_2的含量為10.56±1.72mmol/g,而HIRI組心肌組織內(nèi)H_2O_2含量為14.63±2.25 mmol/g。HIRI組大鼠心肌組織內(nèi)H_2O_2的含量明顯高于Con組(P0.01)6大鼠心肌組織內(nèi)EC-SOD mRNA的相對(duì)表達(dá)量大鼠心肌組織內(nèi)抗氧化物酶EC-SOD mRNA的相對(duì)表達(dá)量采用RT-PCR的方法測(cè)定。計(jì)算與內(nèi)參照GAPDH的比值得出其相對(duì)表達(dá)量并進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。分析表明:HIRI組大鼠心肌組織的EC-SODmRNA水平(1.01±0.15)均明顯高于Con組(0.69±0.11,P0.01)。說明HIRI組大鼠心肌組織內(nèi)EC-SOD的表達(dá)明顯增強(qiáng)。7大鼠心肌組織中EC-SOD的蛋白相對(duì)表達(dá)量采用Western blotting的方法測(cè)定大鼠心肌組織內(nèi)EC-SOD的蛋白相對(duì)表達(dá)量。計(jì)算與內(nèi)參照GAPDH的比值得出相對(duì)表達(dá)量并進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。分析表明:HIRI組大鼠心肌組織中EC-SOD蛋白的相對(duì)表達(dá)量(0.69±0.09)明顯高于對(duì)照組(0.48±0.07)(P0.01)。結(jié)論:1結(jié)扎肝左、中血管和膽管蒂可成功建立大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型。2大鼠肝缺血再灌注損傷模型心肌組織內(nèi)MDA含量、H_2O_2含量和血清LDH活性均明顯增加,提示:心肌組織已遭受過氧化損傷,心肌功能受損。3心肌組織內(nèi)EC-SOD的mRNA和蛋白表達(dá)水平在肝臟缺血再灌注損傷模型心肌組織中明顯增強(qiáng)。提示:抗氧化酶EC-SOD在此過程中可能發(fā)揮了抗氧化作用。
【關(guān)鍵詞】：肝缺血再灌注損傷模型 EC-SOD MDA H_2O_2 氧化應(yīng)激 LDH
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R657.3
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-15
• 前言15-17
• 材料與方法17-26
• 結(jié)果26-28
• 附圖28-36
• 附表36-40
• 討論40-42
• 結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-46
• 綜述 肝缺血再灌注損傷機(jī)制及對(duì)心肌的影響46-59
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 致謝59-60
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷60

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本文編號(hào)：1100113