本文關鍵詞：EC-SOD在大鼠肝缺血再灌注損傷模型心肌內的表達變化

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【摘要】：肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)是肝臟外科手術如肝臟移植、肝部分切除等臨床治療過程中經(jīng)常會發(fā)生的并發(fā)癥,這也是引發(fā)患者肝移植失敗,肝功能衰竭及愈后較差的關鍵因素。眾多研究已表明:暫時性阻斷肝臟血流供應,然后再重新恢復其灌注時可誘發(fā)氧化應激反應的發(fā)生,產(chǎn)生大量高活性的活性氧族(reactive oxygen species:ROS),ROS對肝臟組織細胞引發(fā)的過氧化損傷是導致HIRI的主要機制。ROS的成員主要有超氧陰離子(O~(2-).)、過氧化氫(H_2O_2)以及羥自由基(OH.)等。ROS的生物化學性質極其活潑,能與胞內和胞膜上的一些重要蛋白(如結構蛋白和功能蛋白)和脂質發(fā)生過氧化反應,從而破壞胞膜的結構,損害細胞功能,甚至引起細胞和組織的死亡。肝臟不僅是糖類、蛋白和脂類等物質的重要代謝場所,還是重要的分泌、排泄和生物轉化器官。因此,當其結構和功能受到損害時必然會引起機體內其他重要臟器的結構和功能異常。心臟是機體內氧氣消耗量大、對缺血缺氧反應極為敏感的臟器。當暫時阻斷肝臟血供再重新恢復其灌注,肝組織細胞遭受氧化應激損傷時,心臟是否也會遭受過氧化損傷?有待研究。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutases,SOD)是機體內重要的抗氧化酶之一,它能催化O~(2-)氧化生成氧和H_2O_2。因此,SOD是清除O~(2-)的重要酶蛋白,在機體內的抗過氧化過程具有重要作用。哺乳動物體內共有三種SOD亞型:在線粒體內以錳作為輔基的錳-超氧化物歧化酶(Mn-SOD),在細胞胞漿中以銅和鋅作為輔基的銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)。細胞外超氧化物歧化酶(extracellular SOD,EC-SOD)是機體內唯一位于細胞外的SOD亞型,它依靠自身的肝素結合域(heparin-binding domain,HBD)能與細胞外基質和細胞表面結合。以往眾多的抗氧化功能研究主要集中于Cu/Zn-SOD和Mn-SOD。但最近的實驗研究發(fā)現(xiàn):細胞外的EC-SOD在機體內的抗氧化應激和抗炎反應中可能發(fā)揮了更重要的作用。研究顯示:心肌組織內EC-SOD含量降低的病人,其發(fā)生高血壓和缺血性心臟疾病的風險明顯增加。EC-SOD與細胞外基質結合能力下降也會增加心血管和缺血性心臟疾病的風險。此外,心臟衰竭患者的EC-SOD表達是降低的。這表明EC-SOD可能對維持心肌功能具有重要作用。EC-SOD在肝臟缺血再灌注損傷模型心肌組織內的表達如何變化,是否在此過程中發(fā)揮了抗氧化作用,未見報道。本研究通過阻斷大鼠肝左葉、肝中葉的血管和膽管蒂再重新恢復其灌注的方法制造大鼠HIRI模型,然后觀察大鼠心肌組織內MDA含量、H_2O_2含量、血清LDH水平,以及EC-SOD的mRNA和蛋白表達水平。探討肝臟缺血再灌注損傷發(fā)生后心肌組織內的氧化應激狀態(tài)以及EC-SOD的抗氧化作用。目的:觀察大鼠肝缺血再灌注損傷模型心肌組織內的MDA和H_2O_2含量,抗氧化酶EC-SOD的mRNA和蛋白表達水平的改變,探討肝缺血再灌注損傷發(fā)生后心肌組織的氧化應激狀態(tài)及EC-SOD在此過程中可能發(fā)揮的抗氧化作用。方法:1大鼠肝缺血再灌注損傷模型的制備及取材選用12只雄性健康Wistar大鼠,體重190-210g,于河北醫(yī)科大學實驗動物中心購得。隨機分為肝缺血再灌注損傷組(HIRI)6只,對照組(Con)6只。6%水合氯醛(自配)按0.5ml/kg計量,對大鼠進行腹腔注射,將其麻醉。參照Kohli等人的方法,用玻璃針輕柔分離肝血管和膽管,游離出通往肝中葉和肝左葉的血管和膽管蒂,用無損傷血管夾將其夾閉。30分鐘后移開血管夾,恢復肝中葉和肝左葉的血液供應,制造肝實質70%的肝缺血再灌注損傷模型。對照組大鼠麻醉后,只游離肝中葉和肝左葉的血管和膽管蒂,30分鐘后關腹。肝臟恢復血供6小時后再次將其麻醉,收集大鼠血液,用于ALT(丙氨酸氨基轉移酶)和LDH(血清乳酸脫氫酶)的活性測定;取大鼠肝臟,將其置于4%多聚甲醛溶液中進行固定,用HE染色法觀察大鼠肝組織的形態(tài)學改變;取大鼠心臟,用冰生理鹽水洗去心臟表面及心腔內的余血,并將心臟置于液氮中用于EC-SOD的mRNA水平和蛋白水平測定,以及MDA含量和H_2O_2含量測定。2測定指標及方法2.1 HE染色法觀察大鼠肝臟的形態(tài)結構肝組織經(jīng)常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明,石蠟包埋后,進行切片,厚度約5μm,用蘇木精伊紅染色,在日產(chǎn)Olympus光學顯微鏡下觀察大鼠肝臟組織的形態(tài)結構變化。2.2大鼠血清中ALT活性的測定大鼠血液未經(jīng)抗凝處理,3000rpm離心10min后分離血清,用血清ALT全自動生化分析儀測定其含量。2.3大鼠血清中LDH活性的測定大鼠血液LDH活性的測定,按照試劑盒的操作說明,采用LD-L速率法測定。2.4大鼠心肌勻漿的制備以及MDA含量的測定從-80℃冰箱中取出肝缺血再灌注損傷組及對照組大鼠的心肌組織,按照10mg/100μl的比例,加入4度勻漿緩沖液(PH7.4,磷酸鉀緩沖液50mmol/L,PMSF1mmol/L,鹽酸苯甲脒1mmol/L,Na Cl0.5mol/L,0.1%Tween-20,β-巰基乙醇5mmol/L,EDTANa31mmol/L),冰浴中勻漿,4℃勻漿液4000rpm離心20分鐘,取上清即制成10%心組織勻漿,心組織勻漿內MDA含量經(jīng)南京建成丙二醛(MDA)測定試劑盒測定。2.5大鼠心肌組織H_2O_2含量測定將從-70℃冰箱中取出的心肌組織按照10mg/100μl加入預冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液,PH7.4,1mmol/L鹽酸苯甲脒,1mmol/L PMSF,0.1%Tween-20,0.5mol/L Na Cl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巰基乙醇),冰浴中勻漿,勻漿液4000rpm 4℃離心20min,取上清即制成10%心肌組織勻漿。心肌組織勻漿內H_2O_2含量采用鉬酸比色法測定,以每克樣本蛋白所含的過氧化氫的量(mmol/g pro)表示。2.6大鼠心肌組織EC-SOD mRNA水平測定用TRIzol法提取大鼠心肌組織總RNA。將3μg RNA反轉錄生成c DNA。用GAPDH作為內參照,進行RT-PCR。用EC-SOD擴增產(chǎn)物的灰度值與GAPDH擴增產(chǎn)物的灰度值相比,表示目的基因EC-SOD的相對表達量。2.7大鼠心肌組織EC-SOD蛋白水平測定采用Western blotting的方法測定大鼠心肌組織內EC-SOD蛋白的相對表達量。將-80度冷凍的大鼠心肌組織制成勻漿液,離心后取上清。采用改良的Lowry法進行蛋白總量測定。大鼠心肌組織的蛋白上樣量為62ug。經(jīng)轉膜、封閉處理后,在PVDF膜上加入兔抗EC-SOD一抗,室溫靜置過夜。洗膜后,再加入辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG二抗。按照發(fā)光試劑操作說明進行顯影、定影、晾干。后對膠片進行掃描處理,并做圖像分析,以EC-SOD條帶的灰度值與內參照GAPDH灰度值之比表示EC-SOD的相對表達量。結果:1大鼠肝臟形態(tài)學改變在光學顯微鏡下可見肝缺血再灌注損傷組大鼠的肝組織淤血嚴重,肝細胞受壓萎縮,肝血竇擴張充血明顯,肝細胞胞漿內有空泡出現(xiàn)并且染色變淺,有部分肝細胞水腫,染色變淺,體積增大。對照組大鼠肝細胞排列整齊成條索狀,圍繞中央靜脈排列成放射狀,肝血竇無擴張充血大小均勻。2血清ALT水平Con組大鼠血清中ALT為20.03±5.23U/L,而HIRI組血清ALT為87.43±9.06 U/L。HIRI組大鼠血清ALT水平明顯高于Con組(P0.01)。3血清LDH水平Con組大鼠血清中LDH為481.5±67.15U/L,而HIRI組血清LDH為658.83±94.15 U/L。HIRI組大鼠血清LDH水平明顯高于Con組(P0.01)4心肌組織內MDA的含量Con組大鼠心肌組織MDA的含量為9.24±1.72mmol/g,而HIRI組MDA含量為12.73±1.84 mmol/g。HIRI組大鼠心肌組織MDA的含量明顯高于Con組(P0.01)5心肌組織內H_2O_2含量Con組大鼠心肌組織內H_2O_2的含量為10.56±1.72mmol/g,而HIRI組心肌組織內H_2O_2含量為14.63±2.25 mmol/g。HIRI組大鼠心肌組織內H_2O_2的含量明顯高于Con組(P0.01)6大鼠心肌組織內EC-SOD mRNA的相對表達量大鼠心肌組織內抗氧化物酶EC-SOD mRNA的相對表達量采用RT-PCR的方法測定。計算與內參照GAPDH的比值得出其相對表達量并進行結果統(tǒng)計。分析表明:HIRI組大鼠心肌組織的EC-SODmRNA水平(1.01±0.15)均明顯高于Con組(0.69±0.11,P0.01)。說明HIRI組大鼠心肌組織內EC-SOD的表達明顯增強。7大鼠心肌組織中EC-SOD的蛋白相對表達量采用Western blotting的方法測定大鼠心肌組織內EC-SOD的蛋白相對表達量。計算與內參照GAPDH的比值得出相對表達量并進行結果統(tǒng)計。分析表明:HIRI組大鼠心肌組織中EC-SOD蛋白的相對表達量(0.69±0.09)明顯高于對照組(0.48±0.07)(P0.01)。結論:1結扎肝左、中血管和膽管蒂可成功建立大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型。2大鼠肝缺血再灌注損傷模型心肌組織內MDA含量、H_2O_2含量和血清LDH活性均明顯增加,提示:心肌組織已遭受過氧化損傷,心肌功能受損。3心肌組織內EC-SOD的mRNA和蛋白表達水平在肝臟缺血再灌注損傷模型心肌組織中明顯增強。提示:抗氧化酶EC-SOD在此過程中可能發(fā)揮了抗氧化作用。
【關鍵詞】：肝缺血再灌注損傷模型 EC-SOD MDA H_2O_2 氧化應激 LDH
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R657.3
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-15
• 前言15-17
• 材料與方法17-26
• 結果26-28
• 附圖28-36
• 附表36-40
• 討論40-42
• 結論42-43
• 參考文獻43-46
• 綜述 肝缺血再灌注損傷機制及對心肌的影響46-59
• 參考文獻54-59
• 致謝59-60
• 個人簡歷60

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本文編號：1100113