本文關(guān)鍵詞：大劑量腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的作用及其可能機(jī)制

  更多相關(guān)文章： 轉(zhuǎn)染 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 自噬 PC-12細(xì)胞

【摘要】：第一部分:腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)PC-12神經(jīng)細(xì)胞活性的影響及其可能機(jī)制目的觀察外源性腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)對(duì)PC-12神經(jīng)細(xì)胞的影響及可能機(jī)制。方法體外培養(yǎng)高分化的PC-12神經(jīng)細(xì)胞,經(jīng)胰酶溶解計(jì)數(shù)后均勻接種于96孔板并分為2組:BDNF組:分別加入125μg.L-1,250μg.L-1,500μg.L-1及1000μg.L-1BDNF處理;對(duì)照組:加入相同劑量的溶劑。觀察給藥處理24h后PC-12細(xì)胞的數(shù)量變化。并以磺基羅丹明B法(sulforhodamine B,SRB)檢測(cè)PC-12細(xì)胞的存活率。另取上述細(xì)胞于給藥后24h固定,采用免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞泛素結(jié)合蛋白P62/SQSTM1的表達(dá)變化。結(jié)果1.給藥24h后神經(jīng)細(xì)胞存活率的變化:與對(duì)照組相比,125μg.L-1BDNF組,250μg.L-1BDNF組,500μg.L-1BDNF組細(xì)胞存活率無(wú)明顯變化(P0.05),1000μg.L-1BDNF組細(xì)胞存活率明顯減低(P0.05)。2.給藥24h后細(xì)胞內(nèi)P62的變化:免疫熒光結(jié)果顯示,與對(duì)照組對(duì)比,BDNF各劑量組細(xì)胞內(nèi)P62表達(dá)均減少(P0.05),而1000μg.L-1BDNF組細(xì)胞內(nèi)P62蛋白減少最明顯。結(jié)論1000μg.L-1BDNF可致神經(jīng)細(xì)胞存活率明顯減低,可能與細(xì)胞自噬強(qiáng)度增加有關(guān)。第二部分:PIK3C3 siRNA-pool抑制大鼠PC-12神經(jīng)細(xì)胞P62/SQSTM1的表達(dá)目的探索可高效抑制大鼠PC-12神經(jīng)細(xì)胞上磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PIK3C3)表達(dá)的小干擾RNA(small interference rna,sirna)的使用劑量及作用時(shí)間,并觀察其對(duì)pc-12細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用。方法設(shè)計(jì)并合成針對(duì)pik3c3的sirna3對(duì)(sirna125、sirna943、sirna2283)及一條帶綠色熒光標(biāo)記的陰性對(duì)照f(shuō)am-sirna。在lipofectamine2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染pc-12細(xì)胞。pc-12細(xì)胞隨機(jī)分為normal組,vehicle組,mismatch組,pik3c3sirna25nmol.l-1組、50nmol.l-1組、100nmol.l-1組。轉(zhuǎn)染6h后,于熒光顯微鏡下計(jì)算轉(zhuǎn)染復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率,使用mtt法檢測(cè)轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性,采用real-timepcr法測(cè)定sirna-pool的抑制率,采用細(xì)胞免疫化學(xué)的方法檢測(cè)細(xì)胞泛素結(jié)合蛋白p62/sqstm1的表達(dá)變化。結(jié)果sirna轉(zhuǎn)染效率可隨載體使用劑量的增加而升高。轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性低,各組細(xì)胞成活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。pik3c3sirna50nmol.l-1組、sirna100nmol.l-1組可抑制pik3c3的表達(dá),sirna100nmol.l-1組干擾pc-12細(xì)胞后,pik3c3mrna相對(duì)表達(dá)量較低。sirna100nmol.l-1組轉(zhuǎn)染pc-12細(xì)胞48h后,p62/sqstm1的相對(duì)表達(dá)量升高。結(jié)論sirna100nmol.l-1組能有效地抑制pc-12上pik3c3mrna的表達(dá),且引起自噬有關(guān)蛋白p62/sqstm1的表達(dá)升高,抑制pc-12細(xì)胞的自噬。第三部分:pik3c3sirna通過(guò)抑制自噬的過(guò)度激活對(duì)bdnf致大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用目的觀察預(yù)給予pik3c3sirna轉(zhuǎn)染pc-12細(xì)胞對(duì)大劑量外源性bdnf對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。方法將體外培養(yǎng)的pc-12細(xì)胞分為六組,分別為:normal組(n組),vehicle組(v組),mismatch組(m組)組,bdnf組(b組),pik3c3sirna組(s組),bdnf+pik3c3sirna100nmol.l-1組(bs組)。其中b組及bs組bdnf濃度為1000μg.l-1,bs組轉(zhuǎn)染試劑pik3c3sirna于實(shí)驗(yàn)前24h以100nmol.l-1的濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞后再加入1000μg.l-1bdnf作用24h。通過(guò)mtt法(n=5)檢測(cè)pc-12神經(jīng)細(xì)胞活性的變化、real-timepcr法(n=3)檢測(cè)與自噬有關(guān)的p62/sqstm1基因及l(fā)c3基因的表達(dá)、細(xì)胞免疫化學(xué)(n=4)、細(xì)胞免疫熒光(n=4)法在蛋白水平上檢測(cè)p62/sqstm1蛋白及l(fā)c3蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果細(xì)胞活性變化:與n組比較,b組神經(jīng)細(xì)胞存活率明顯下降(p0.01),其他各組細(xì)胞存活率變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與B組相比,BS組神經(jīng)細(xì)胞活力明顯增加(P0.01)。real-time PCR結(jié)果顯示:與N組相比,B組P62/SQSTM1mRNA相對(duì)表達(dá)量下降(P0.01),LC3mRNA相對(duì)表達(dá)量則增高(P0.01),S組P62/SQSTM1mRNA相對(duì)表達(dá)量增高(P0.05),LC3mRNA相對(duì)表達(dá)量則下降(P0.05),BS組P62/SQSTM1基因相對(duì)表達(dá)量下降(P0.05),LC3mRNA相對(duì)表達(dá)量則高于N組(P0.01),V組與M組基因表達(dá)水平與N組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與B組相比,BS組P62/SQSTM1mRNA相對(duì)表達(dá)量增高(P0.01),LC3mRNA相對(duì)表達(dá)量則下降(P0.05)。細(xì)胞免疫化學(xué)與免疫熒光結(jié)果顯示:與N組相比,B組P62/SQSTM1蛋白表達(dá)減少(P0.01),LC3蛋白表達(dá)增高(P0.01),S組P62/SQSTM1蛋白表達(dá)增高(P0.01),LC3蛋白表達(dá)下降(P0.01),V組、M組、BS組兩類(lèi)蛋白的表達(dá)水平與N組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與B組相比,BS組P62/SQSTM1蛋白表達(dá)水平增高(P0.01),LC3蛋白水平則明顯下降(P0.01)。結(jié)論P(yáng)IK3C3siRNA可通過(guò)抑制自噬的過(guò)度激活對(duì)大劑量BDNF致大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：轉(zhuǎn)染 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 自噬 PC-12細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R614
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 前言11-15
• 參考文獻(xiàn)13-15
• 第一部分 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)PC-12神經(jīng)細(xì)胞活性的影響15-23
• 實(shí)驗(yàn)材料15-16
• 實(shí)驗(yàn)方法16-18
• 結(jié)果18-20
• 討論20-21
• 參考文獻(xiàn)21-23
• 第二部分 PIK3C3 siRNA-pool抑制大鼠PC-12細(xì)胞P62/SQSTM1的表達(dá)23-35
• 實(shí)驗(yàn)材料23-24
• 實(shí)驗(yàn)方法24-27
• 結(jié)果27-32
• 討論32-33
• 參考文獻(xiàn)33-35
• 第三部分 PIK3C3siRNA通過(guò)抑制自噬的過(guò)度激活對(duì)BDNF致大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用35-47
• 實(shí)驗(yàn)材料35
• 實(shí)驗(yàn)方法35-36
• 結(jié)果36-45
• 討論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-47
• 結(jié)論47-48
• 綜述48-54
• 參考文獻(xiàn)51-54
• 中英文縮略詞表54-55
• 攻讀學(xué)位期間公開(kāi)發(fā)表的論文55-56
• 基金資助56-57
• 致謝57-58

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本文編號(hào)：1095477