本文關(guān)鍵詞：ROS敏感材料載SDF-1α納米粒趨化BMSCs歸巢、促進創(chuàng)面血管化的研究

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【摘要】：研究背景創(chuàng)面修復(fù)是一個復(fù)雜的生物系統(tǒng)工程,其中有多種細(xì)胞、生長因子及細(xì)胞因子共同參與,通過多種細(xì)胞水平及分子水平的改變,重建皮膚的屏障功能。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)作為一種具有多向分化潛能的細(xì)胞,可參與皮膚重建過程的血管化及上皮化過程。但是BMSCs的動員、趨化、聚集主要由基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell derived factor 1,SDF-1)的趨化作用實現(xiàn)。當(dāng)組織損傷或缺血、缺氧時,可以誘導(dǎo)局部組織的SDF-1表達(dá)上調(diào),產(chǎn)生的SDF-1可趨化、誘導(dǎo)BMSCs到損傷部位并歸巢,參與局部血管化和創(chuàng)面修復(fù)。因此,局部形成高濃度SDF-1是吸引并捕捉干細(xì)胞參與血管修復(fù)的必要條件。然而,如何在局部形成SDF-1濃度梯度分布是一個難題。直接局部血管內(nèi)注射SDF-1迅速被血液稀釋進入全身循環(huán)而不能在局部形成有效濃度;而直接組織內(nèi)注射SDF-1分布不均勻,易降解,且進入循環(huán)的效率不確定。將蛋白質(zhì)多肽類藥物通過可生物降解的微球系統(tǒng)給藥,不僅能有效防止藥物在體內(nèi)的快速降解,還可將藥物靶向輸送至體內(nèi)有效部位,達(dá)到定向釋放效應(yīng)。在臨床治療中,病變部位發(fā)生的物理、化學(xué)或生物特性的改變,均能作為引起納米粒反應(yīng)的靶點。而活性氧(reactive oxygen species,ROS)就是這樣一個在生物體內(nèi)正常存在的物質(zhì),在多種疾病如創(chuàng)傷和炎癥性疾病中過量產(chǎn)生。因此為載藥納米粒的靶向釋放提供新的靶點。在本課題中,我們設(shè)想利用硫醇縮酮聚合物PPADT作為納米粒載體,制備出包載SDF-1的ROS敏感納米顆粒,通過靜脈給藥,使納米顆粒能在創(chuàng)面周圍組織釋放SDF-1,在局部形成了有效穩(wěn)定的SDF-1濃度梯度,從而促進BMSCs向損傷局部趨化歸巢,促進創(chuàng)周局部血管化,加快創(chuàng)面愈合。研究方法:1、載SDF-1α的ROS敏感納米粒(SDF-1α-PPADT)的構(gòu)建及體外鑒定(1)ROS敏感硫醇縮酮聚合物(PPADT)的合成合成PPADT;通過生物核磁共振(1H-NMR,13C-NMR)和凝膠滲透色譜(GPC)驗證其化學(xué)結(jié)構(gòu)與分子量,確證所獲得的PPADT化學(xué)結(jié)構(gòu)與預(yù)期相符。(2)SDF-1α-PPADT納米粒的制備與性能鑒定采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)發(fā)制備SDF-1α-PPADT納米粒;通過透射電子顯微鏡(TEM)、粒徑分析儀觀測其表征;(3)BCA法測納米粒中蛋白含量,計算SDF-1α-PPADT載藥量。(4)CCK8法評價納米粒的細(xì)胞毒性試驗;(5)SDF-1α-PPADT納米粒的體外釋放實驗,評價納米粒的ROS敏感釋放行為;(6)Transwell小室實驗評價納米粒中SDF-1α的生物活性;2、SDF-1α-PPADT納米粒對急性創(chuàng)面小鼠的體內(nèi)實驗研究(1)PPADT納米粒的體內(nèi)生物毒性評價靜脈輸注納米粒后,觀察動物死亡率,血清酶學(xué)(CK、ALT、AST),HE染色觀察主要臟器病理學(xué)改變。(2)評價SDF-1α-PPADT納米粒在動物模型體內(nèi)的靶向釋放(3)評價SDF-1α-PPADT納米粒對體內(nèi)SDF-1α的影響(4)評價SDF-1α-PPADT納米粒對BMSCs的趨化和歸巢作用通過外源性綠色熒光蛋白標(biāo)記的BMSCs,觀察SDF-1α-PPADT對BMSCs的局部趨化作用,激光共聚焦顯微鏡觀察創(chuàng)周GFP+CD31+的細(xì)胞數(shù)量。(5)評價SDF-1α-PPADT納米粒對創(chuàng)周血管化影響及創(chuàng)面愈合的影響免疫組化觀察創(chuàng)周組織血管化程度(CD31)。動態(tài)觀察創(chuàng)面愈合時間,記錄創(chuàng)面愈合率。研究結(jié)果1、合成的活性氧敏感高分子材料PPADT分子量為11544Da,分散度為1.974,可作為納米粒的載體。通過復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備SDF-1α-PPADT納米粒,納米粒粒徑為124.7±27.47nm,載藥率為1.8%,透射電子顯微鏡下觀察,納米顆粒呈球形,大小均勻,無粘連。2、不同濃度PPADT納米粒與小鼠肺泡巨噬細(xì)胞RAW264.7共同培養(yǎng)24小時,CCK8法檢測發(fā)現(xiàn)各組PPADT納米粒對細(xì)胞增殖活性均無影響。將SDF-1α-PPADT納米粒分別暴露于PBS溶液(低ROS)與Fenton試劑(高ROS)中釋放,48h內(nèi)PBS溶液中的納米粒僅有5%釋放。而Fenton試劑中的納米粒在8h時已釋放了82.56%,并在48h內(nèi)完全釋放。通過Transwell小室實驗評價納米粒中的SDF-1α的活性,結(jié)果表明相同濃度的SDF-1標(biāo)準(zhǔn)品與納米粒中SDF-1α趨化活性比為1:0.73。3、不同濃度的SDF-1α-PPADT納米粒靜脈注入小鼠體內(nèi),7天觀察期內(nèi)小鼠全部存活。病理切片觀察主要臟器,未發(fā)現(xiàn)明顯病理改變或炎細(xì)胞浸浸潤。CK,AST和ALT酶學(xué)指標(biāo)也未有明顯改變(P0.05)。動物模型靜脈注射Cy5-SDF-1α-PPADT納米粒6小時后,小動物成像儀可見創(chuàng)周高熒光區(qū)域。全層皮膚缺損模型組給予SDF-1α-PPADT納米粒治療后,血清中SDF-1α水平及創(chuàng)周SDF-1α水平24小時內(nèi)均能穩(wěn)定維持在較高水平。全層皮膚缺損模型輸注SDF-1α-PPADT納米粒后,創(chuàng)周組織免疫組化可見血管化程度較對照組更高,CD31陽性細(xì)胞更多。而同時輸注SDF-1α-PPADT和GFP-BMSCs 3天后,創(chuàng)周冰凍切片可見SDF-1α-PPADT組較其它組有更多GFP+CD31+的細(xì)胞。而且SDF-1α-PPADT組創(chuàng)面愈合較其他組更快。研究結(jié)論1、成功合成了ROS敏感的高分子有機材料PPADT。通過復(fù)乳溶劑揮發(fā)法,成功制備出符合粒徑要求、具有一定載藥量的SDF-1α-PPADT納米粒。2、合成的SDF-1α-PPADT納米粒具有ROS敏感活性。可在高濃度ROS環(huán)境中釋放SDF-1α。且釋放出的SDF-1α仍保留有較強趨化活性。該納米粒對細(xì)胞增殖無明顯毒副作用,細(xì)胞相容性良好。3、合成的SDF-1α-PPADT納米粒對動物無明顯生物毒性,生物相容性好。靜脈使用可以實現(xiàn)在創(chuàng)面周圍靶向釋放。提高循環(huán)與創(chuàng)面周圍SDF-1α含量。促進BMSCs向創(chuàng)面聚集歸巢;促進創(chuàng)面血管化,促進創(chuàng)面愈合。
【關(guān)鍵詞】：納米粒 活性氧簇 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 創(chuàng)面愈合
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R641
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-13
• 英文縮寫表13-16
• 第一部分 載SDF-1α的ROS敏感納米粒的構(gòu)建及體外鑒定16-46
• 前言16-19
• 材料和方法19-33
• 實驗結(jié)果33-42
• 討論42-45
• 結(jié)論45-46
• 第二部分 SDF-1α-PPADT納米粒在急性創(chuàng)面小鼠的體內(nèi)實驗研究46-69
• 前言46-47
• 材料和方法47-56
• 實驗結(jié)果56-66
• 討論66-68
• 結(jié)論68-69
• 全文小結(jié)69-70
• 文獻(xiàn)綜述 ROS敏感材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用70-77
• 參考文獻(xiàn)77-85
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說明85-86
• 致謝86-87

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本文編號：1029733