本文關(guān)鍵詞：阿魏酸鈉洗脫支架的制備及生物學(xué)性能研究

  更多相關(guān)文章： 阿魏酸鈉 內(nèi)皮細(xì)胞 再狹窄 紫杉醇 藥物釋放動(dòng)力學(xué) 生物可降解聚合物 支架

【摘要】：研究背景和目的： 缺血性腦血管疾病是高度致殘致死性疾病，占腦血管疾病的75%-85%，30%-60%的缺血性腦血管病的發(fā)生可歸因于頸動(dòng)脈的狹窄，外科干預(yù)治療頸動(dòng)脈狹窄的主要措施包括頸動(dòng)脈球囊擴(kuò)張成形術(shù)，頸動(dòng)脈支架植入術(shù)，頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)和搭橋手術(shù)。然而這些干預(yù)措施之后，再狹窄也隨之發(fā)生，血管管腔直徑逐漸減少，缺血癥狀再次出現(xiàn)，甚至導(dǎo)致血管閉塞。因此術(shù)后再狹窄的發(fā)生嚴(yán)重影響了手術(shù)的遠(yuǎn)期收益和療效[1]，再狹窄的發(fā)生相當(dāng)普遍，腦血管，冠脈血管，腎動(dòng)脈，及其他外周血管術(shù)后均會(huì)出現(xiàn)不同程度的狹窄。新生內(nèi)膜過度增生是球囊成形術(shù)后和支架植入術(shù)后再狹窄的主要病理特征[2]。新生內(nèi)膜增殖是指血管平滑肌大量增殖并進(jìn)入血管內(nèi)膜或中層結(jié)構(gòu)，它是血管內(nèi)膜層受損后普遍存在的反應(yīng)。新生內(nèi)膜形成與許多因素有關(guān)。內(nèi)皮損傷是其中一個(gè)關(guān)鍵因素[3]，光滑完整的內(nèi)皮層能降低血栓和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[4]，內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞密切相關(guān)，它調(diào)節(jié)著血管的收縮節(jié)律，并且通過一氧化氮、內(nèi)皮素和前列腺素等途徑調(diào)節(jié)著平滑肌的增殖。平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，分化型平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)變成分化程度較低的分泌型細(xì)胞（未分化或去分化型），其增殖和遷移能力增強(qiáng)，這是新生內(nèi)膜形成的關(guān)鍵步驟之一[3]。 血管成形術(shù)是一種機(jī)械擴(kuò)張狹窄或阻塞血管，使血管通暢的手術(shù)技術(shù)，病變血管狹窄和閉塞往往是由動(dòng)脈粥樣硬化而導(dǎo)致。血管成形術(shù)是一種微創(chuàng)手術(shù)，它通過球囊導(dǎo)管到達(dá)血管狹窄部位，充盈球囊壓迫粥樣硬化斑塊，使斑塊壓縮至血管壁，然后回撤塌陷球囊，開放血管恢復(fù)血流。支架可以在球囊擴(kuò)張的時(shí)候一并放入以維持血管開放狀態(tài)。為降低再狹窄發(fā)生率，血管支架在不斷改進(jìn)，生物學(xué)性能也更加優(yōu)秀。支架由最初的裸金屬支架，演化出涂層支架，藥物洗脫支架和可降解支架等。藥物洗脫支架已成為心血管介入手術(shù)中應(yīng)用較為廣泛的植入器械。紫杉醇、雷帕霉素及其類似物被用于藥物洗脫支架，有效抑制了平滑肌增殖，但是這些不可控、非特異的影響細(xì)胞周期的藥物也明顯抑制了血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長，阻止內(nèi)皮重新愈合，導(dǎo)致晚期血栓形成和晚期支架內(nèi)再狹窄[5-11]。許多其他藥物也被試驗(yàn)性的用于涂層支架，，其目的是減少再狹窄和血栓的發(fā)生，可是效果并不理想。例如，皮質(zhì)類固醇激素地塞米被用于治療炎癥、免疫疾病，還能抑制平滑肌細(xì)胞增殖[12]，但是臨床研究顯示地塞米松洗脫支架并不能有效抑制再狹窄。BENESTENT II試驗(yàn)對(duì)肝素涂層支架的抗再狹窄作用進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果表明肝素涂層支架的促凝性明顯降低，但是并沒抑制新生內(nèi)膜增生，對(duì)再狹窄沒有改善[13]。由于支架植入術(shù)后病人需長期口服抗血小板藥物，肝素涂層支架實(shí)際作用受到質(zhì)疑。磷酸膽堿是細(xì)胞膜的主要成分，具有良好的血液相容性和組織相容性。將磷酸膽堿涂層支架植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（兔和豬）體內(nèi)發(fā)現(xiàn)既沒有促進(jìn)新生內(nèi)膜增生，也沒有抑制再狹窄[14]。理想的藥物涂層應(yīng)能抑制平滑肌增生，同時(shí)促進(jìn)內(nèi)皮生長、愈合；完整光滑功能良好的內(nèi)皮也是防止血栓形成的重要條件。因此，重視內(nèi)皮功能恢復(fù)就有可能降低再狹窄率發(fā)生[15-17]，新的有效藥物成為研究的熱點(diǎn)，同時(shí)也是臨床治療的關(guān)鍵。 阿魏酸是一種源于植物的酚酸，它及其鈉鹽形式阿魏酸鈉（sodium ferulate，SF）有多重生物學(xué)作用，包括抗腫瘤[18]，抗動(dòng)脈粥樣硬化[19,20]，抗血小板[21,22]，抗氧化，抗炎[23,24]。然而目前阿魏酸鈉對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞作用的研究較少，其作用機(jī)制仍不清楚。本研究利用細(xì)胞培養(yǎng)和分子生物學(xué)技術(shù)觀察、探討了SF對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響，為SF抗再狹窄作用的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)；然后將阿魏酸鈉和4種多聚物載體相結(jié)合，用浸涂法制作阿魏酸鈉多聚物涂層支架，在顯微鏡及電鏡下觀察自制涂層支架表面形態(tài)學(xué)，利用高效液相色譜技術(shù)測量藥物緩釋動(dòng)力學(xué)，體外實(shí)驗(yàn)檢測血液相容性，為動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。 方法： 培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，用不同濃度阿魏酸鈉處理細(xì)胞，分為6組，對(duì)照組0μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml，100μg/ml和1000μg/ml，在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，即處理24小時(shí)和48小時(shí)，用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活性。同樣，采用劃痕愈合試驗(yàn)觀察不同藥物濃度對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。采用免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot觀察細(xì)胞內(nèi)叉頭蛋白M1（FoxM1）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)。另一方面，用浸涂法制作阿魏酸鈉多聚物涂層支架，顯微鏡和掃面電鏡下觀察阿魏酸鈉多聚物涂層支架的表面形態(tài)；高效液相色譜測量自制涂層支架阿魏酸鈉的釋放量；通過溶血率、凝血酶原時(shí)間和活化部分凝血活酶時(shí)間實(shí)驗(yàn)，檢測自制涂層支架血液相容性。 結(jié)果： 1.阿魏酸鈉處理HUVECs24小時(shí)后，在10μg/ml和100μg/ml處理組，細(xì)胞活性與對(duì)照組相比明顯提高；48小時(shí)后，細(xì)胞增殖趨勢更加明顯，在0.1-100μg/ml組細(xì)胞活性與對(duì)照組相比明顯提高，然而在1000μg/ml處理組，細(xì)胞活性降低明顯（P0.05）。 2.處理12小時(shí)，在1-100μg/ml組中，細(xì)胞遷移能力與對(duì)照組相比增強(qiáng)；處理24小時(shí)后，在0.1-100μg/ml組中，細(xì)胞遷移能力與對(duì)照組相比明顯增強(qiáng)；處理48小時(shí)后，在0.1-100μg/ml組，細(xì)胞遷移能力與對(duì)照組相比增強(qiáng)，然而在1000μg/ml處理組中，細(xì)胞遷移能力明顯受抑制（P0.05）。 3.藥物處理12小時(shí)后，在1-100μg/ml組，細(xì)胞內(nèi)FoxM1紅色熒光的強(qiáng)度與對(duì)照相比明顯增強(qiáng)，在0.1-100μg/ml組，HUVECs內(nèi)VEGF紅色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（P0.05）。 4.Western blot分析FoxM1和VEGF表達(dá)量的變化，研究發(fā)現(xiàn)，藥物處理12和24小時(shí)后，在0.1-100μg/ml處理組，F(xiàn)oxM1的表達(dá)均較對(duì)照組顯著提高；藥物處理12小時(shí)，在10-100μg/ml處理組，VEGF中表達(dá)較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，處理24小時(shí)后，與對(duì)照組相比，VEGF的表達(dá)在0.1-100μg/ml處理組中均增強(qiáng)（P0.05）。 5.四種多聚物涂層支架（PLGA50，PLGA75，PDLLA和PLLA），涂層表面形態(tài)均一完整，較少出現(xiàn)多聚物聚集、橋接、開裂、剝脫等現(xiàn)象。4種涂層無明差異。 6. PLGA50和PLGA75支架組與PDLLA和PLLA相比，釋放更為持續(xù)、良好。PLGA50和PLGA75釋放量高于PDLLA和PLLA組。 7.裸支架組和4種多聚物涂層支架組（PLGA50，PLGA75，PDLLA和PLLA），溶血率均5%。四種多聚物涂層支架組PT和APTT與商品化金屬裸支架組無明顯差異。 結(jié)論： 阿魏酸鈉促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，上調(diào)了FoxM1和VEGF的表達(dá)，呈劑量依賴性。阿魏酸鈉促進(jìn)內(nèi)皮愈合、修復(fù)的這些特征可能使其成為一種抗再狹窄的藥物或涂層藥物。4種多聚物涂層支架表面形態(tài)學(xué)均勻完整，并具有良好的血液相容性。而PLGA50和PLGA75涂層支架組與PDLLA和PLLA組相比，可能具有更好的藥物釋放動(dòng)力學(xué)。
【關(guān)鍵詞】：阿魏酸鈉 內(nèi)皮細(xì)胞 再狹窄 紫杉醇 藥物釋放動(dòng)力學(xué) 生物可降解聚合物 支架
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R651.12;R318.08
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-11
• Abstract11-15
• 前言15-17
• 文獻(xiàn)回顧17-26
• 第一部分 阿魏酸鈉對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作用的機(jī)制研究26-37
• 1 材料26-27
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器26
• 1.2 主要試劑26-27
• 2 方法27-30
• 2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)27-28
• 2.2 人臍靜脈細(xì)胞處理及分組28
• 2.3 CCK-8 測阿魏酸鈉對(duì) HUVEC 增殖的影響28
• 2.4 劃痕愈合試驗(yàn)檢測阿魏酸鈉對(duì) HUVEC 遷移的影響28
• 2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)分析細(xì)胞內(nèi) FoxM1 和 VEGF 的變化28-29
• 2.6 阿魏酸鈉對(duì) HUVECs 中 FoxM1 和 VEGF 蛋白表達(dá)的影響29-30
• 2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理30
• 3 結(jié)果30-34
• 3.1 阿魏酸鈉對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響30-31
• 3.2 阿魏酸鈉對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響31-32
• 3.3 阿魏酸鈉對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi) FoxM1 和 VEGF 表達(dá)的影響32-33
• 3.4 阿魏酸鈉誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 FoxM1 和 VEGF 表達(dá)33-34
• 4 討論34-37
• 第二部分 阿魏酸鈉涂層支架制備及血液相容性研究37-47
• 1 材料37-38
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器37
• 1.2 主要試劑37-38
• 2 方法38-41
• 2.1 阿魏酸鈉涂層支架的制作及分組38
• 2.2 阿魏酸鈉涂層支架表面形態(tài)學(xué)檢查38
• 2.3 涂層支架阿魏酸鈉釋放動(dòng)力學(xué)檢測38-39
• 2.4 阿魏酸鈉涂層支架血液相容性檢測39-40
• 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理40-41
• 3 結(jié)果41-44
• 3.1 阿魏酸鈉涂層支架表面形態(tài)學(xué)41-42
• 3.2 阿魏酸鈉涂層支架藥物釋放動(dòng)力學(xué)42-43
• 3.3 阿魏酸鈉涂層支架血液相容性43-44
• 4 討論44-47
• 小結(jié)47-48
• 參考文獻(xiàn)48-58
• 研究成果58

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 趙克洪,沈江明;高齡老年患者頸動(dòng)脈粥樣硬化與心血管危險(xiǎn)因素及缺血性腦卒中的相關(guān)規(guī)律[J];中國臨床康復(fù);2004年13期

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本文編號(hào)：797203