本文關(guān)鍵詞：重力矢量及趨化誘導(dǎo)對(duì)脂肪干細(xì)胞在PLGA電紡膜上早期黏附增殖的影響

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【摘要】：目的 以體外原代培養(yǎng)人脂肪干細(xì)胞(Adipose-derived stem cells, ASCs)為研究對(duì)象,觀察不同重力矢量條件,以及血小板衍生生長(zhǎng)因子(Platelet-derived growth factor, PDGF)影響下,ASCs在PLGA電紡膜表面的黏附定植情況。探討重力因素和趨化因子對(duì)干細(xì)胞在組織工程支架上的黏附定植和增殖功能活動(dòng)的影響及其二者之間的相互作用。 材料和方法 1、PLGA電紡膜制備以24ml三氯甲烷(Trichloromethane, TCM,分析純)和6ml N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide, DMF,分析純)按體積比8:2混合,將5.4g聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid, PLGA,固有粘度0.76dl/g,重均分子量80,000Da)與之溶解混合成18%質(zhì)量體積比電紡溶液。在推射速率1ml/h、場(chǎng)電壓14KV、噴射距離12cm條件下,靜電紡絲法制備PLGA電紡膜。成品厚度約為600μm,最大可利用面積約26.0×19.0cm2,密度約為0.172g/cm3,質(zhì)量為5.4g。PLGA電紡膜裁剪為直徑4.5min圓形試件后密封,鉆-60輻射消毒24h(累積放射劑量25K Gy)后保存待用。 2、ASCs提取無(wú)菌條件下提取新鮮的面部輪廓整形手術(shù)所切取的人頰脂墊脂肪組織10ml,剪碎為1mm3體積的顆粒,以Ⅰ型膠原酶消化,離心法獲得ASCs,加入完全DMEM培養(yǎng)基,在37℃、5%二氧化碳、飽和濕度條件下原代培養(yǎng)至第14天時(shí),對(duì)培養(yǎng)皿底部貼壁細(xì)胞以0.25%胰蛋白酶消化,計(jì)數(shù),每3天換液,達(dá)到80%融合時(shí)傳代。ASCs傳至第5代(Passage Five, P5)時(shí),-80℃冰箱冷凍保存。 3、實(shí)驗(yàn)分組常規(guī)復(fù)蘇課題組前期凍存的P5ASCs。復(fù)蘇后每3天換液,達(dá)到80%融合時(shí)傳代。取生長(zhǎng)良好的P6ASCs,0.25%胰蛋白酶消化,在DMEM培養(yǎng)液內(nèi)調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)至3×104/ml。將該ASCs細(xì)胞懸液按100μl/孔(細(xì)胞數(shù)量3000)依次加入96孔板。依照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為四組,每組3孑L：(1)PDGF/重力矢量(+)組：用微量加樣槍滴加1μl含0.01ng PDGF的磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline, PBS)至PLGA電紡膜上,置于培養(yǎng)孔底,細(xì)胞懸液鋪于PLGA電紡膜之上；(2)PBS／重力矢量(+)組：滴加1μl空白PBS至PLGA電紡膜上,置于培養(yǎng)孔底,細(xì)胞懸液鋪于PLGA電紡膜上；(3)PDGF/重力矢量(-)組：用微量加樣槍滴加1μl含0.01ngPDGF的PBS至PLGA電紡膜上,將膜覆蓋于培養(yǎng)孔細(xì)胞懸液上方；(4)PBS/重力矢量(一)組：用微量加樣槍滴加1μl空白PBS至PLGA電紡膜上,將膜覆蓋于培養(yǎng)孔細(xì)胞懸液上方。 4、檢測(cè)分析將96孔板置于37℃、5%二氧化碳、飽和濕度條件下培養(yǎng),分別于第0,1,3,5,8,11天同一時(shí)間點(diǎn),每組取3孔,加入10μl Alamar Blue試劑,繼續(xù)孵化。24h后在570nm和600nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定細(xì)胞懸液內(nèi)的OD值,參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組PLGA電紡膜上定植ASCs的相對(duì)數(shù)量及其增殖功能活動(dòng)情況。分析PDGF趨化吸引對(duì)于ASCs在PLGA電紡膜上黏附的趨化作用,以及重力因素與該趨化作用之間的相互影響。進(jìn)一步探討對(duì)于具有一定體積和三維空間結(jié)構(gòu)的組織工程支架,上述因素可能產(chǎn)生的影響作用。 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS20.0軟件,進(jìn)行重復(fù)測(cè)量的三因素一元方差分析,以P0.05為有顯著性差異。 結(jié)果 1、針對(duì)重力矢量方向的影響作用,在添加PDGF的實(shí)驗(yàn)組,重力矢量(+)組在第1、2、4、6、9、12天的Alamar Blue下降百分?jǐn)?shù)均顯著高于同一時(shí)間點(diǎn)重力矢量(-)組。顯示重力矢量方向?qū)?xì)胞在支架材料表面的黏附及進(jìn)一步的增殖活動(dòng)產(chǎn)生明顯的影響,并且貫穿實(shí)驗(yàn)始終。 而在添加空白PBS的對(duì)照組,也呈現(xiàn)類似的結(jié)果。說(shuō)明有利的重力矢量方向是對(duì)ASCs的黏附定植和增殖產(chǎn)生決定性影響的因素。 2、針對(duì)PDGF勺趨化誘導(dǎo)作用,在重力矢量(+)條件下,添加PDGF實(shí)驗(yàn)組的Alamar Blue在第1、2、4天的下降百分?jǐn)?shù)與同一時(shí)間點(diǎn)添加PBS對(duì)照組無(wú)明顯差別,但第6、9、12天的下降百分?jǐn)?shù)明顯高于同一時(shí)間點(diǎn)添加PBS的對(duì)照組。提示在重力矢量有利的環(huán)境中,趨化吸引并不對(duì)ASCs早期的黏附和定植具有明顯影響；一旦ASCs進(jìn)入快速增殖期,趨化因子可具有顯著促進(jìn)作用。 在重力矢量(-)條件下,添加PDGF實(shí)驗(yàn)組第1、2、4、6、9、12天的下降百分?jǐn)?shù)叫顯高于同一時(shí)間點(diǎn)添加PBS的對(duì)照組。說(shuō)明在重力矢量方向不利的環(huán)境中,趨化誘導(dǎo)效應(yīng)能部分抵消不利影響,促進(jìn)ASCs黏附定植與增殖。 3、相對(duì)ASCs在PLGA電紡膜上增殖活動(dòng)的時(shí)問(wèn)-空間變化趨勢(shì)而言,隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間間期延長(zhǎng),可見(jiàn)各組ASCs增殖活動(dòng)明顯提高,且各時(shí)間點(diǎn)之間具有顯著性差異；結(jié)果提示,ASCs在支架上黏附定植后,均有明顯的增殖活動(dòng)。在同一時(shí)間點(diǎn)(第6,9,12天)橫向?qū)Ρ?各組ASCs的增殖活動(dòng)水平亦具有顯著性差異；提示重力矢量方向和PDGF趨化吸引作用,均對(duì)細(xì)胞在組織工程支架上的黏附與增殖具有明顯影響,二者具有交互效應(yīng),并隨時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)ASCs的增殖疊加影響,各實(shí)驗(yàn)組間產(chǎn)生顯著性差異。 在本實(shí)驗(yàn)中,隨實(shí)驗(yàn)間期延長(zhǎng),采取有利的重力矢量方向以及PDGF趨化誘導(dǎo)組的ASCs在支架上的黏附定植和增殖呈現(xiàn)出相對(duì)于其他各組明顯的優(yōu)勢(shì)。 結(jié)論 1、靜電紡絲制備的PLGA電紡膜,孔隙率高,纖維交織構(gòu)成疏松多孔結(jié)構(gòu),近似細(xì)胞間質(zhì)的支架作用,有利于ASCs種子細(xì)胞黏附定植及增殖。 2、細(xì)胞因子PDGF具有明顯誘導(dǎo)ASCs趨化聚集作用,能顯著改善ASCs在PLGA電紡膜支架上的黏附與增殖。 3、重力矢量因素對(duì)于ASCs在PLGA電紡膜上的黏附定植與增殖功能活動(dòng)具有顯著影響,有利的重力矢量方向是對(duì)ASCs的黏附定植和增殖產(chǎn)生決定性影響的因素。 4、重力矢量方向和PDGF趨化吸引作用,均對(duì)種子細(xì)胞在組織工程支架上的黏附與增殖具有明顯影響,二者具有交互效應(yīng),并隨時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)ASCs的增殖疊加影響。 5、應(yīng)用趨化因子誘導(dǎo)能在早期有效地促進(jìn)種子細(xì)胞在支架材料的黏附與聚集,并可明顯克服不利重力矢量因素影響,提高組織工程效能。
【關(guān)鍵詞】：脂肪干細(xì)胞 組織工程 PDGF 重力矢量 細(xì)胞黏附 細(xì)胞增殖
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R318.08
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 縮略語(yǔ)13-14
• 前言14-16
• 研究現(xiàn)狀、成果14
• 研究目的、方法14-16
• 實(shí)驗(yàn)一 PLGA電紡膜的制備16-24
• 1.1 實(shí)驗(yàn)背景16-17
• 1.2 儀器設(shè)備17
• 1.3 原料和試劑17
• 1.4 靜電紡絲設(shè)備示意圖17-18
• 1.5 PLGA電紡膜的制備18-19
• 1.5.1 PLGA電紡溶液的配制18
• 1.5.2 PLGA的靜電紡絲18
• 1.5.3 PLGA電紡膜干燥18-19
• 1.5.4 PLGA電紡膜消毒19
• 1.5.5 SEM觀察PLGA 電紡膜表面特征和形貌19
• 1.6 結(jié)果19-21
• 1.7 討論21-24
• 實(shí)驗(yàn)二 重力矢量及趨化誘導(dǎo)對(duì)脂肪干細(xì)胞在PLGA電紡膜上早期黏附X椫車撓跋，
  
  本文編號(hào)：788340
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