本文關(guān)鍵詞：滾壓載荷生物反應(yīng)器促進(jìn)兔軟骨細(xì)胞—絲素蛋白多孔支架復(fù)合體生成功能化關(guān)節(jié)軟骨的研究

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【摘要】：軟骨在人的日常生活中發(fā)揮著重要的作用,一旦軟骨受到破壞人的日常活動(dòng)會(huì)受到極大的影響。但軟骨組織缺乏充足的血供和淋巴循環(huán),其修復(fù)和再生能力有限。由關(guān)節(jié)炎和創(chuàng)傷導(dǎo)致的骨關(guān)節(jié)軟骨損傷常常導(dǎo)致瘢痕愈合，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能的喪失，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量。在眾多的治療修復(fù)手段中，運(yùn)用組織工程技術(shù)制造功能化的關(guān)節(jié)軟骨成為最具有應(yīng)用前景的方式。在工程化軟骨的生成過(guò)程中，生物材料及力學(xué)作用對(duì)生成的軟骨組織的結(jié)構(gòu)及功能有重要的影響。絲素蛋白是一種天然蛋白，孔隙率高，對(duì)水及氧氣有良好的滲透性，生物相容性很好，其促血凝作用很低，，細(xì)胞在其上的粘附增殖能力很強(qiáng)，可降解，具有良好的生物學(xué)彈性，在組織工程中得到大量的應(yīng)用。在正常的關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)中，關(guān)節(jié)軟骨受到了多種力學(xué)作用，包括直接壓縮力、靜水壓、流動(dòng)剪切力等。研究也發(fā)現(xiàn)力學(xué)作用可以改善組織工程支架的力學(xué)性能。許多生物生物反應(yīng)器被應(yīng)用于軟骨組織工程中。直接的動(dòng)態(tài)壓縮及流動(dòng)剪切力可以增加軟骨細(xì)胞支架的細(xì)胞增殖和基質(zhì)合成含量，力學(xué)性能也得到很大的改善。仿生滾壓載荷生物反應(yīng)器最大程度的模擬生理狀態(tài)下軟骨組織的受力模式，對(duì)工程軟骨進(jìn)行直接壓縮及流動(dòng)剪切力作用。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究仿生力學(xué)的滾壓加載生物反應(yīng)器及絲素蛋白多孔支架的共同作用下對(duì)工程軟骨的生成影響。 目的：觀察仿生力學(xué)加載對(duì)絲素蛋白多孔支架-軟骨細(xì)胞復(fù)合體生成工程軟骨的影響。 方法：將2.5月齡新西蘭兔的軟骨組織在酶解法作用下分離出軟骨細(xì)胞，培養(yǎng)至第3代后將軟骨細(xì)胞接種于絲素蛋白多孔支架。將實(shí)驗(yàn)樣本分為力學(xué)加載組和靜態(tài)培養(yǎng)組。在接種后24小時(shí)后，對(duì)力學(xué)加載組施加10%壓縮形變量0.33Hz2小時(shí)/天5天/周的仿生力學(xué)加載；靜態(tài)對(duì)照組的培養(yǎng)條件和滾壓加載組相同。分別在第3、7、14、21天時(shí)取各組樣品行細(xì)胞活性檢測(cè)，實(shí)時(shí)定量PCR，DAN、GAG和膠原含量檢測(cè)以及組織學(xué)染色，觀察細(xì)胞在滾壓加載及靜態(tài)培養(yǎng)支架上的存活、增殖、軟骨特異性基因及蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：絲素蛋白具有良好的生物相容性。細(xì)胞活性染色表明力學(xué)加載組和靜態(tài)培養(yǎng)組絲素-軟骨細(xì)胞支架中的死活細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞在支架中的存活率無(wú)差別。細(xì)胞接種后24小時(shí)，可見(jiàn)細(xì)胞均勻的分布于支架中，活細(xì)胞比大于96%。第7、14、21天時(shí)，力學(xué)加載組和靜態(tài)培養(yǎng)組的活細(xì)胞比例差別不大，力學(xué)加載組90.26%±2.3%，靜態(tài)培養(yǎng)組為89±1.2%。絲素蛋白-軟骨細(xì)胞復(fù)合體在靜態(tài)培養(yǎng)時(shí)，蛋白聚糖持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)；I型膠原、II型膠原的表達(dá)逐漸升高，分別在7天、14天時(shí)表達(dá)下調(diào)。絲素-軟骨細(xì)胞培養(yǎng)物靜態(tài)培養(yǎng)時(shí)，蛋白多糖及總膠原的表達(dá)也持續(xù)增高。 復(fù)合培養(yǎng)體在滾壓加載后細(xì)胞的軟骨特異性基因的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高（P＜0.05）。在第7、14天時(shí)滾壓加載組的蛋白聚糖表達(dá)分別是靜態(tài)組的1.623倍（P=0.04）、3.298倍（P=0.002）；但3、21天時(shí)，滾壓加載組蛋白聚糖是靜態(tài)組的0.72倍（P=0.26）、0.88倍（P=0.72），但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。滾壓組的II型膠原基因的表達(dá)也較靜態(tài)培養(yǎng)組高（P＜0.05）。在3、7、14、21天時(shí)，滾壓加載組的表達(dá)量分別是靜態(tài)組的5.4倍（P＜0.01）、13.7倍（P＜0.01）、2.05倍（P=0.107）、4.51倍（P＜0.01）。I型膠原在滾壓加載組出現(xiàn)短暫的表達(dá)上調(diào)，在第3天時(shí)，相對(duì)于靜態(tài)組升高了2.95倍（P＜0.01）。在7天、14天、21天時(shí)，滾壓加載的I型膠原表達(dá)是對(duì)照組的0.70倍（P=0.34）、1.26倍（P=0.47）、1.38倍（P=0.09），但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 滾壓加載組的蛋白多糖及總膠原的表達(dá)量高于靜態(tài)培養(yǎng)組（P＜0.05）。第3、7、14、21天時(shí)滾壓加載組的蛋白多糖為12.17±1.835μg/(μgDAN)，17.367±2.48μg/(μg DAN)，25.83±1.56μg/(μg DAN)，30.25±3.41μg/(μg DAN),分別是靜態(tài)組的分別是靜態(tài)組的1.71倍（P=0.01），1.66倍（P=0.06），1.62倍（P＜0.01），1.76倍（P＜0.01）。第3、7、21天滾壓組膠原是靜態(tài)組的1.23倍（P=0.08）、0.73倍（P=0.17）、1.09倍（P=0.26），但無(wú)明顯差異；在14天為1.52倍（P=0.045），表達(dá)高于靜態(tài)組。但絲素-軟骨細(xì)胞復(fù)合體合成的大量蛋白多糖流失入培養(yǎng)基中，復(fù)合培養(yǎng)物中的含量較低；在21天時(shí)滾壓加載組支架中蛋白多糖保留率（10.5%）明顯低于靜態(tài)組（16.5%）（P＜0.05），支架中蛋白多糖含量無(wú)差異。組織染色表明蛋白多糖均勻分布于復(fù)合培養(yǎng)體中，但滾壓組和靜態(tài)對(duì)照組的蛋白多糖無(wú)明顯差別，與生化檢測(cè)結(jié)果一致。 結(jié)論：軟骨細(xì)胞在絲素蛋白支架中具有良好的活性，在10%壓縮幅度0.33Hz2小時(shí)/天5天/周的仿生滾壓加載生物反應(yīng)器作用下，絲素-軟骨細(xì)胞復(fù)合物細(xì)胞軟骨表型表達(dá)較好，細(xì)胞合成代謝旺盛，為工程軟骨的再生提供合適的力學(xué)加載模式。
【關(guān)鍵詞】：軟骨細(xì)胞 生物反應(yīng)器 仿生力學(xué)加載 絲素蛋白 組織工程
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R318.08
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 研究論文 滾壓載荷生物反應(yīng)器促進(jìn)兔軟骨細(xì)胞-絲素蛋白多孔支架復(fù)合體生成功能化關(guān)節(jié)軟骨的研究11
• 前言11-12
• 材料與方法12-20
• 結(jié)果20-23
• 附圖23-31
• 附表31-33
• 討論33-36
• 結(jié)論36
• 參考文獻(xiàn)36-43
• 綜述 靜水壓力促進(jìn)工程軟骨生成的研究進(jìn)展43-54
• 參考文獻(xiàn)49-54
• 致謝54-55
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷55

【共引文獻(xiàn)】

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4 范會(huì)龍;規(guī)則被動(dòng)運(yùn)動(dòng)對(duì)兔膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損修復(fù)的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2010年

本文編號(hào)：784143