本文關鍵詞：綠色工藝制備聚乙烯亞胺衍生物在細胞支架和介導基因轉染中的研究

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【摘要】：聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI)作為典型的陽離子聚合物之一，已經(jīng)廣泛應用于組織工程支架以及作為基因轉染的載體。由于PEI本身血液相容性較差，細胞毒性大等缺點嚴重制約了其進一步應用。利用化學方法對PEI分子改性是一種有效降低其細胞毒性和改善血液相容性的方法。生物材料通過靜電紡絲技術制備的具有極大比表面積的納米纖維可以很好地模擬天然細胞外基質，為細胞的粘附、增殖及為生理功能提供良好的微環(huán)境。 本論文結合兩性離子化合物良好的生物相容性優(yōu)勢，設計合成兩性離子化合物PEI衍生物。利用高壓靜電紡絲技術制備PEI-C/聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)的低毒復合納米纖維，考察其纖維性能和細胞毒性；研究改性后的PEI(PEI-C)作為基因載體時在水溶液中與質粒DNA(Plasmid deoxyribonucleic acid, pDNA)之間的相互作用、納米復合物的形成、載體的生物相容性、細胞毒性及基因復合物在體外的轉染等性能。 本論文的研究內(nèi)容主要分為以下幾個方面： （1）利用綠色化學的理念，基于富氨基類聚合物對二氧化碳有很強的吸附性這一特點，結合兩性離子化合物良好的生物相容性的優(yōu)勢，用二氧化碳對超支化PEI25KDa進行改性，制備出聚乙烯亞胺衍生物(PEI-C)。通過核磁（NMR）、元素含量檢測和傅氏轉換紅外線光譜分析儀（FT-IR）對所制備的衍生物進行表征確認其結構。考察二氧化碳吸收時間、PEI反應濃度等影響因素，結果表明：PEI濃度控制在20%~40%之間；當二氧化碳在通入0.5h后，PEI中氧元素含量已達到27%。MTT細胞毒性實驗表明，與未修飾的PEI25K相比，，PEI-C材料的細胞的相對存活率維持在80%左右；而PEI的細胞毒性隨其濃度增加，細胞存活率從80%左右降低到30%以下，表明PEI-C的細胞毒性顯著降低。 （2）采用靜電紡絲手段，將PEI-C和PVA制備成具有良好纖維形貌的含不同比例的PEI-C/PVA復合納米纖維，用戊二醛蒸汽交聯(lián)得到水穩(wěn)定的納米纖維膜。掃描電子顯微鏡（SEM）、FT-IR等手段表征其纖維膜交聯(lián)前后的形貌及結構變化。通過對紡絲液濃度、電壓、接收距離和流速等條件的優(yōu)化，得到了具有良好纖維形貌的含不同比例的PEI-C/PVA復合納米纖維支架。以雪旺細胞（schwann cell）為模型細胞來研究該材料的生物相容性。研究表明，雪旺細胞在PEI-C/PVA復合纖維支架表面分布相比未改性的PEI/PVA復合纖維基質更為密集，細胞形態(tài)明顯較好，更利于細胞生長；MTT細胞毒性實驗進一步表明，PEI-C/PVA在質量比為35：65時，纖維支架細胞的OD值為0.47，相當于同等條件下PEI/PVA纖維支架OD值的2倍，證實改性后的復合纖維支架的細胞毒性明顯降低。 （3）將所制備的PEI-C材料用于介導基因轉染的研究。蛋白吸附實驗表明二氧化碳修飾后的PEI-C材料抵御蛋白質吸附的能力增強；脫氧核糖核酸酶I的防護和釋放實驗表明，PEI-C載體材料有保護pDNA免受細胞中核酸酶降解并且可以釋放pDNA。使用凝膠電泳儀考察載體與pDNA的結合能力，采用動態(tài)光散射(DLS)和Zeta電位儀考察載體與pDNA形成的復合物的粒徑和電位。MTT細胞毒性實驗表明，與未修飾的PEI載體基因復合物(pDNA/PEI)相比，PEI-C載體基因復合物(pDNA/PEI-C)的細胞毒性顯著降低；體外轉染實驗表明，PEI-C能夠有效地介導基因轉染。以Hepa1-6細胞和QBC939細胞為模型細胞，在有血清情況下，PEI-C作為載體時在Hepa1-6細胞和QBC939細胞的轉染率為33%以上達到甚至高于PEI25KDa作為載體時的轉染效率。隨著N/P的增加，轉染效率從33%左右增長到62%左右；在無血清情況下轉染，其PEI-C作為載體在兩種癌細胞的轉染效率也維持在20%以上，比PEI25KDa作為載體時的轉染效率高2.5倍左右，激光共聚焦圖片也與其吻合。實驗結果表明PEI-C能夠有效地介導基因轉染。
【關鍵詞】：聚乙烯亞胺改性 復合納米纖維 細胞支架 基因載體 轉染
【學位授予單位】：東華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R318.08
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-11
• 目錄11-13
• 第一章 緒論13-30
• 1.1 引言13
• 1.2 聚乙烯亞胺及其衍生物13-20
• 1.2.1 聚乙烯亞胺的性質13-15
• 1.2.2 聚乙烯亞胺的應用15-16
• 1.2.3 聚乙烯亞胺的改性16-20
• 1.3 納米纖維膜用于模擬細胞外基質20-24
• 1.3.1 細胞外基質生物材料的發(fā)展20-21
• 1.3.2 靜電紡絲概述21-22
• 1.3.3 靜電紡絲納米纖維膜的應用22-24
• 1.4 介導基因轉染24-28
• 1.4.1 基因轉染簡介24-25
• 1.4.2 非病毒基因轉染載體25-27
• 1.4.3 高分子基因載體介導基因傳遞的一般過程27-28
• 1.5 本課題的提出及主要研究內(nèi)容28-29
• 1.6 本論文工作的創(chuàng)新之處在于以下幾個方面29-30
• 第二章 聚乙烯亞胺衍生物的制備及表征30-41
• 2.1 引言30-31
• 2.2 實驗部分31-34
• 2.2.1 實驗原料及儀器31
• 2.2.2 綠色合成聚乙烯亞胺衍生物 PEI-C31
• 2.2.3 13C NMR 核磁分析31-32
• 2.2.4 全反射傅里葉紅外光譜儀（ATR-FTIR）分析32
• 2.2.5 熱重(TG)分析32
• 2.2.6 元素分析32-33
• 2.2.7 PEI-C 材料的 MTT 實驗33-34
• 2.3 結果與討論34-40
• 2.3.1 PEI-C 的結構分析34-38
• 2.3.2 PEI-C 細胞毒性評價38-40
• 2.4 總結40-41
• 第三章 PEI-C/PVA 復合納米纖維的制備及表征41-54
• 3.1 前言41-42
• 3.2 實驗部分42-45
• 3.2.1 實驗原料及儀器42
• 3.2.2 靜電紡制備 PEI-C/PVA 和 PEI/PVA 復合納米纖維42-44
• 3.2.3 PEI-C/PVA 和 PEI/PVA 復合納米纖維膜疏水化處理44
• 3.2.4 PEI-C/PVA 和 PEI/PVA 復合納米纖維膜的表征44
• 3.2.5 復合納米纖維膜體外細胞毒性檢測44-45
• 3.3 結果與討論45-53
• 3.3.1 復合納米纖維膜細胞毒性的研究45-51
• 3.3.2 體外細胞生長和細胞毒性試驗51-53
• 3.4 本章小結53-54
• 第四章 PEI-C/pDNA 復合體的制備及在轉染方面的應用54-68
• 4.1 引言54-55
• 4.2 實驗部分55-59
• 4.2.1 實驗原料及儀器55
• 4.2.2 酸堿滴定55-56
• 4.2.3 RFP 質粒 DNA 的提取56-57
• 4.2.4 pDNA/PEI-C 復合物的制備57
• 4.2.5 pDNA/PEI-C 復合物凝膠電泳實驗57
• 4.2.6 pDNA/PEI-C 復合物粒徑、表面電荷的測試57
• 4.2.7 透射電鏡（TEM）57
• 4.2.8 蛋白質吸附實驗57-58
• 4.2.9 DNase I 的保護和釋放實驗58
• 4.2.10 細胞毒性實驗58-59
• 4.2.11 體外轉染實驗59
• 4.3 結果與討論59-67
• 4.3.1 PEI-C 聚合物質子緩沖能力的研究59-60
• 4.3.2 PEI-C 聚合物與 pDNA 結合能力的研究60-61
• 4.3.3 pDNA/PEI-C 復合物粒徑和電位的研究61-62
• 4.3.4 PEI-C 聚合物與蛋白質吸附作用62-63
• 4.3.5 PEI-C 聚合物對 DNA 的保護作用63-64
• 4.3.6 pDNA/PEI-C 復合物的細胞毒性評價64-65
• 4.3.7 體外細胞轉染評價65-67
• 4.4 本章小結67-68
• 第五章 總結與展望68-70
• 5.1 總結68-69
• 5.2 展望69-70
• 參考文獻70-81
• 碩士期間發(fā)表的論文和專利81-83
• 致謝83

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 盧麗萍;王芳芳;吳敏;;聚乙烯醇/殼聚糖/硝酸鈰共混纖維氈的制備及其對Cr(Ⅵ)的吸附性能[J];紡織學報;2012年05期

2 張穎 ,王志 ,王世昌;Facilitated Transport of CO_2 Through Synthetic Polymeric Membranes[J];Chinese Journal of Chemical Engineering;2002年05期

本文編號：646205