本文關(guān)鍵詞：三維人工皮膚構(gòu)建及鼠李糖脂促皮膚傷口愈合研究

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【摘要】：皮膚是人體最大的器官,其不僅作為與外界環(huán)境接觸的屏障,還起到維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用。由于燒傷和慢性愈合傷口的大量發(fā)生,自體皮膚移植不足以滿足皮膚移植的需求,這使人工皮膚受到越來越多的關(guān)注。其中,包含表皮層與真皮層的3D人工皮膚更接近真實(shí)的皮膚,在移植及作為皮膚研究模型上的應(yīng)用價(jià)值明顯高于其他人工皮膚。本文采用自行分離和培養(yǎng)的原代人皮膚成纖維細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞,并優(yōu)化3D人工皮膚的構(gòu)建,在降低成本的基礎(chǔ)上獲得更好的人工皮膚。此外,鼠李糖脂是一種優(yōu)良的生物表面活性劑,具有優(yōu)越的表/界面活性、低毒性等特點(diǎn),在醫(yī)藥領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。本文利用體外模型考察鼠李糖脂對皮膚傷口愈合和抗疤痕修復(fù)的作用。首先,從小兒環(huán)切手術(shù)后的包皮中分離原代人皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn),角質(zhì)細(xì)胞在原代成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上的增殖情況優(yōu)于鼠成纖維細(xì)胞系(NIH3T3)飼養(yǎng)層；飼養(yǎng)層的接種密度對角質(zhì)細(xì)胞的生長有很大影響,其與角質(zhì)細(xì)胞接種密度為1：1時(shí),角質(zhì)細(xì)胞的增殖最優(yōu)。此外,消化角質(zhì)細(xì)胞的酶也在很大程度上影響細(xì)胞活率和增殖,國產(chǎn)的胰酶不能將角質(zhì)細(xì)胞消化下來,且對細(xì)胞的損傷大,而胰酶替代物TrypLETE可以用來消化角質(zhì)細(xì)胞,且對細(xì)胞的損傷小。其次,將角質(zhì)細(xì)胞接種于膠原包埋的成纖維細(xì)胞,氣提培養(yǎng)獲得3D人工皮膚。本文比較角質(zhì)細(xì)胞增殖培養(yǎng)基Epi Ⅰ中鈣離子的含量對表皮形成的影響,發(fā)現(xiàn)與高鈣培養(yǎng)基相比,不含鈣或低鈣的培養(yǎng)基培養(yǎng)皮膚時(shí),可獲得更完整的表皮層。隨后,本文采用鼠尾和牛尾Ⅰ型膠原構(gòu)建真皮層,比較兩者的收縮性,測量人工皮膚的水接觸角以考察其疏水性,并以蘇木素-伊紅染色(HE)、天狼猩紅及免疫熒光染色進(jìn)一步表征人工皮膚的組織形態(tài)。結(jié)果顯示,牛尾Ⅰ型膠原制作的皮膚在培養(yǎng)21天時(shí),其面積只下降了21%,而鼠尾Ⅰ型膠原制作的皮膚收縮至原來的一半。牛尾Ⅰ型膠原構(gòu)建的皮膚表面水接觸角與人皮膚接近,表明其比鼠尾Ⅰ型膠原構(gòu)建的皮膚疏水性更好。HE和免疫熒光染色觀察組織形態(tài),可見完整的皮膚結(jié)構(gòu),含表皮層與真皮層;且牛尾Ⅰ型膠原構(gòu)建的皮膚表皮層與鼠尾Ⅰ型膠原相比呈更多層。最后,本文采用體外模型評價(jià)了鼠李糖脂的促皮膚傷口愈合及抗傷疤作用。通過2D劃痕愈合實(shí)驗(yàn)分析,發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂能促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞系HaCaT的遷移,及在成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),鼠李糖脂也有明顯的促細(xì)胞遷移效果；初步闡明了其促傷口愈合的原因。此外,鼠李糖脂能抑制肌成纖維細(xì)胞引起的膠原收縮,降低其膠原分泌和重排,說明了其潛在的抗疤痕修復(fù)作用和機(jī)理。綜上所述,采用原代成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞,以牛尾Ⅰ型膠原為真皮層支架,可構(gòu)建疏水性和結(jié)構(gòu)完整性均接近真實(shí)皮膚的3D人工皮膚。此外,通過體外皮膚劃痕傷口愈合及抗疤痕模型的研究,初步證實(shí)了鼠李糖脂促傷口愈合和抗疤痕的效果及機(jī)理。
【關(guān)鍵詞】：人工皮膚 角質(zhì)細(xì)胞 成纖維細(xì)胞 膠原 細(xì)胞角蛋白14 飼養(yǎng)層 鼠李糖脂 傷口愈合 抗疤痕
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R318.1;R622
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-25
• 1.1 皮膚的結(jié)構(gòu)與功能12-13
• 1.2 皮膚的傷口愈合及疤痕形成13-15
• 1.3 皮膚的體外模型15-20
• 1.3.1 2D模型15-16
• 1.3.2 3D人工皮膚模型16-19
• 1.3.3 3D人工皮膚的應(yīng)用19-20
• 1.4 促傷口愈合及抗疤痕藥物20-21
• 1.5 鼠李糖脂及其促傷口愈合的研究21-24
• 1.5.1 鼠李糖脂的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)21-22
• 1.5.2 鼠李糖脂的生物安全性22-23
• 1.5.3 鼠李糖脂促傷口愈合和抗疤痕的研究23-24
• 1.6 本課題研究思路24-25
• 第二章 材料與方法25-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑25-26
• 2.1.1 主要儀器25
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑25-26
• 2.2 原代細(xì)胞的分離與培養(yǎng)26-29
• 2.2.1 人皮膚成纖維細(xì)胞的分離26-27
• 2.2.2 人皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)27
• 2.2.3 人皮膚角質(zhì)細(xì)胞的分離27-28
• 2.2.4 人皮膚角質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)28
• 2.2.5 角質(zhì)細(xì)胞的鑒定28-29
• 2.3 3D人工皮膚的構(gòu)建和表征29-32
• 2.3.1 Ⅰ型膠原的制備29
• 2.3.2 3D人工皮膚的構(gòu)建29-30
• 2.3.3 皮膚組織石蠟包埋切片30
• 2.3.4 皮膚組織切片HE染色30-31
• 2.3.5 皮膚組織切片免疫熒光染色31
• 2.3.6 皮膚組織切片天狼猩紅染色31
• 2.3.7 接觸角測量31-32
• 2.4 鼠李糖脂對膠原包埋成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的研究32-33
• 2.4.1 成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化32
• 2.4.2 膠原收縮32
• 2.4.3 膠原凝膠的天狼猩紅染色32
• 2.4.4 膠原凝膠的Masson三色染色32-33
• 2.4.5 膠原凝膠的免疫熒光染色33
• 2.5 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)33
• 2.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)33
• 2.7 數(shù)據(jù)分析33-34
• 第三章 人皮膚成纖維和角質(zhì)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)34-42
• 3.1 引言34
• 3.2 人皮膚成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)34-35
• 3.2.1 人皮膚成纖維細(xì)胞的分離34-35
• 3.2.2 人皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代35
• 3.3 角質(zhì)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)35-39
• 3.3.1 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)角質(zhì)細(xì)胞35-36
• 3.3.2 飼養(yǎng)層及含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)角質(zhì)細(xì)胞36-39
• 3.4 角質(zhì)細(xì)胞的消化與傳代39-40
• 3.5 角質(zhì)細(xì)胞鑒定40-41
• 3.6 本章小結(jié)41-42
• 第四章 3D人工皮膚的體外構(gòu)建42-47
• 4.1 引言42
• 4.2 3D人工皮膚的培養(yǎng)條件優(yōu)化42-43
• 4.3 牛尾和鼠尾Ⅰ型膠原構(gòu)建的3D人工皮膚比較43-46
• 4.3.1 牛尾和鼠尾Ⅰ型膠原構(gòu)建皮膚的收縮性43-44
• 4.3.2 牛尾和鼠尾Ⅰ型膠原構(gòu)建皮膚的疏水性比較44
• 4.3.3 牛尾和鼠尾Ⅰ型膠原構(gòu)建人工皮膚的HE染色44-45
• 4.3.4 牛尾和鼠尾Ⅰ型膠原構(gòu)建皮膚的天狼猩紅染色45-46
• 4.4 牛尾Ⅰ型膠原構(gòu)建皮膚的免疫熒光染色46
• 4.5 本章小結(jié)46-47
• 第五章 體外皮膚模型用于鼠李糖脂促傷口愈合及抗疤痕研究47-60
• 5.1 引言47
• 5.2 鼠李糖脂對2D皮膚傷口模型的傷口愈合作用47-53
• 5.2.1 鼠李糖脂對成纖維細(xì)胞遷移的影響47-49
• 5.2.2 鼠李糖脂對角質(zhì)細(xì)胞遷移的影響49-50
• 5.2.3 鼠李糖脂對成纖維和角質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)兩種細(xì)胞遷移的影響50-52
• 5.2.4 鼠李糖脂對角質(zhì)細(xì)胞增殖的影響52-53
• 5.3 鼠李糖脂抗疤痕機(jī)理研究53-59
• 5.3.1 成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)形成肌成纖維細(xì)胞54
• 5.3.2 鼠李糖脂對成纖維/肌成纖維細(xì)胞膠原收縮能力的影響54-55
• 5.3.3 鼠李糖脂下調(diào)肌成纖維細(xì)胞的α-SMA表達(dá)55-56
• 5.3.4 鼠李糖脂對成纖維/肌成纖維細(xì)胞的毒性56-57
• 5.3.5 鼠李糖脂抑制肌成纖維細(xì)胞的膠原分泌及重組57-59
• 5.4 本章小結(jié)59-60
• 第6章 結(jié)論與展望60-62
• 6.1 總結(jié)60
• 6.2 不足之處60-61
• 6.3 展望61-62
• 論文主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)62-63
• 參考文獻(xiàn)63-73
• 作者簡介73

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 馬丹;趙曉娟;付溥博;張西萌;魏海燕;劉莉;曾靜;;3D人工皮膚模型用于化學(xué)品皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)的評估[J];衛(wèi)生研究;2014年01期

2 王雪;金劍;肖長發(fā);;疏水改性聚對苯二甲酸乙二醇酯的合成與表征[J];紡織學(xué)報(bào);2011年04期

3 ;Application of collagen-chitosan/fibrin glue asymmetric scaffolds in skin tissue engineering[J];Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology);2010年07期

4 甘露;曹川;李世榮;李建福;毋巨龍;;以表皮干細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚的比較研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年20期

5 ;Reuse of waste frying oil for production of rhamnolipids using Pseudomonas aeruginosa zju.u1M[J];Journal of Zhejiang University(Science A:An International Applied Physics & Engineering Journal);2007年09期

6 祝君梅,溫庭民;人工皮膚的研究進(jìn)展[J];生物醫(yī)學(xué)工程與臨床;2001年02期

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本文編號(hào)：637714