本文關(guān)鍵詞：不同方法制備大鼠肝臟脫細(xì)胞支架及其免疫原性和細(xì)胞相容性研究

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【摘要】：目前治療終末期肝病的一個(gè)有效方案是肝移植，但因?yàn)楣└尾蛔�，使大多�?shù)終末期肝病患者無(wú)法獲得有效的治療。即使接受了肝移植，病人也需要終身服用免疫抑制劑。肝組織工程的發(fā)展為終末期肝病的治療提供了新的可能。本實(shí)驗(yàn)采用的全器官脫細(xì)胞支架是利用物理（振蕩，高滲，低溫等）、化學(xué)（酸、堿、去垢劑等）或酶解（胰蛋白酶、核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶）等方法去除器官中細(xì)胞成分和遺傳物質(zhì)后得到的生物支架。該支架保留了肝臟完整的三維立體結(jié)構(gòu)和大部分的細(xì)胞外基質(zhì)成分，為后期種植種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程肝臟提供基礎(chǔ)。目前國(guó)內(nèi)外的多家機(jī)構(gòu)通過(guò)不同的方法制備肝臟脫細(xì)胞支架，而我們?cè)谇捌谘芯恐幸怖靡訬P-40和多種生物酶為主的多步方案也成功制備出大鼠肝臟脫細(xì)胞支架。目前尚無(wú)對(duì)幾種洗脫方案系統(tǒng)化的比較。影響支架使用的一個(gè)重要因素是其免疫原性，盡管研究證實(shí)洗脫過(guò)程已去除了引起免疫反應(yīng)的細(xì)胞物質(zhì)，但生物材料移植之后仍可引起強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)。影響支架使用的另一重要因素是其細(xì)胞相容性，通過(guò)在支架上種植種子細(xì)胞觀察其粘附、生長(zhǎng)、分化、遷移情況，可初步判斷制備的脫細(xì)胞支架在清除掉細(xì)胞成分的同時(shí)，是否保留了適于細(xì)胞生長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)和成分。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比兩種傳統(tǒng)方法和一種新方法制備大鼠肝臟脫細(xì)胞支架的理化性質(zhì)、免疫原性以及細(xì)胞相容性，為肝臟組織工程的體內(nèi)、體外研究奠定基礎(chǔ)。 目的： 使用不同方案制備大鼠肝臟脫細(xì)胞支架，檢測(cè)支架成分和體內(nèi)重塑反應(yīng)，以及種植細(xì)胞后細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)情況，比較不同方法制備DLB的免疫原性和生物相容性效果。 方法： 1．選取文獻(xiàn)報(bào)道的三種方案（分別以SDS，Triton X-100和NP-40為主要洗脫成分），制備F344大鼠DLB。 2．免疫原性部分進(jìn)行HE和Masson染色，檢測(cè)DLB中DNA、氨基葡聚糖（GAG）以及羥脯氨酸（HYP）含量；再將DLB埋植于C57BL/6小鼠的背部皮下，于術(shù)后第3、7和14天取出后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和組織學(xué)評(píng)分。 3．細(xì)胞相容性部分進(jìn)行氨基葡聚糖（GAG）檢測(cè)、掃描電鏡、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，后經(jīng)門(mén)靜脈灌注肝卵圓細(xì)胞，進(jìn)行免疫熒光、掃描電鏡、粘附率和白蛋白分泌檢測(cè)。 結(jié)果： 1．三種方案均成功制備出符合脫細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)的大鼠DLB； 2．形態(tài)學(xué)結(jié)果提示Triton X-100和NP-40方案較SDS方案能更好地保護(hù)肝臟超微結(jié)構(gòu)；成分檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)NP-40方案去除DNA的能力顯著強(qiáng)于SDS和Triton X-100方案（P＜0.05），而對(duì)GAG含量的洗脫作用最弱（P＜0.05）；異種體內(nèi)埋置實(shí)驗(yàn)提示NP-40方案制備的DLB引起的免疫反應(yīng)強(qiáng)度明顯弱于SDS和Triton X-100方案，體內(nèi)重塑結(jié)局評(píng)分顯著高于SDS和Triton X-100方案。 3．大體觀察、掃描電鏡及孔徑計(jì)算表明NP-40方案細(xì)胞外基質(zhì)較SDS和TritonX-100方案整齊；GAG檢測(cè)NP-40方案高于Triton X-100方案和SDS方案；支架細(xì)胞毒性結(jié)果證實(shí)支架對(duì)細(xì)胞增殖起促進(jìn)作用；細(xì)胞粘附率結(jié)果表明NP-40方案高于SDS方案和Triton X-100方案；免疫熒光及掃描電鏡示NP-40方案細(xì)胞排列整齊；白蛋白分泌NP-40方案(85.77±3.30mg/106個(gè)細(xì)胞)明顯好于SDS方案(49.37±2.43mg/106個(gè)細(xì)胞)和Triton X-100方案(74.66±4.80mg/106個(gè)細(xì)胞)。 結(jié)論： 與SDS和Triton X-100方案相比，NP-40方案能更有效地去除肝臟DNA，較好地保留GAG，誘導(dǎo)移植受體對(duì)DLB的良性重塑反應(yīng)，，且有利于細(xì)胞在支架上的粘附、生長(zhǎng)、分化、遷移。為進(jìn)一步的體內(nèi)研究提供更優(yōu)化的支架。
【關(guān)鍵詞】：脫細(xì)胞肝支架 肝組織工程 細(xì)胞外基質(zhì) 免疫原性 卵圓細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R318.08
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-13
• 文獻(xiàn)回顧13-31
• 實(shí)驗(yàn)一 不同方法制備大鼠肝臟脫細(xì)胞支架及其免疫原性研究31-42
• 引言31-32
• 1. 材料32-33
• 2. 方法33-35
• 3. 結(jié)果35-40
• 4. 討論40-42
• 實(shí)驗(yàn)二 不同方法制備大鼠肝臟脫細(xì)胞支架及其細(xì)胞相容性研究42-51
• 引言42
• 1. 材料42-43
• 2. 方法43-46
• 3. 結(jié)果46-50
• 4. 討論50-51
• 小結(jié)51-52
• 參考文獻(xiàn)52-62
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果62-64
• 致謝64-65

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：638068