本文關(guān)鍵詞：具有感應(yīng)、調(diào)控尿酸濃度功能的穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選與鑒定

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【摘要】：合成生物學(xué)是后基因組時(shí)代發(fā)展迅猛的一門綜合性交叉學(xué)科,它通過(guò)有目的地設(shè)計(jì)合成新的生物體和改造現(xiàn)有生物體,解決了人類發(fā)展面臨的若干重大問(wèn)題,為解決能源、健康及環(huán)境等重大問(wèn)題帶來(lái)了曙光。在合成生物學(xué)的發(fā)展歷程中,基因回路的設(shè)計(jì)、構(gòu)建及應(yīng)用是重要的成就之一。伴隨著合成生物學(xué)的長(zhǎng)足發(fā)展,基因回路的功能逐步走向功能復(fù)雜和精細(xì)調(diào)控,同時(shí)不斷為人類突破藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)乃至農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的現(xiàn)有科技水平。尿酸(Uric Acid)是嘌呤氧化后的產(chǎn)物,它的溶解度較小,容易形成針狀的尿酸鹽晶體。正常情況下,人體內(nèi)的正常代謝保證尿酸含量處于穩(wěn)定狀態(tài),當(dāng)血尿酸濃度高于420μM稱為高尿酸血癥(hyperuricemia)。當(dāng)體內(nèi)尿酸滯留過(guò)多,會(huì)導(dǎo)致人體體液變酸,影響細(xì)胞正常功能。因此,高尿酸血癥嚴(yán)重危害人類健康,進(jìn)而引發(fā)痛風(fēng)。目前,藥物控制是治療痛風(fēng)的主要方法,但這種方法有其明顯的局限性:過(guò)去,別嘌呤醇藥物是治療痛風(fēng)的主要選擇,它在用藥安全上有著顯著優(yōu)勢(shì)但療效差強(qiáng)人意;伴隨著技術(shù)的進(jìn)步,新型的生物尿酸酶制劑問(wèn)世,對(duì)尿酸濃度的調(diào)控能力得到進(jìn)一步增強(qiáng),但此類藥物容易引起超敏反應(yīng)和耐藥。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展,利用合成的基因回路實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)尿酸濃度的穩(wěn)態(tài)控制成為一種新的趨勢(shì)。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo),耐輻射型球菌R1(Deinococcus radiodurans R1)基因組中,huc R表達(dá)Huc R;Huc R是一種轉(zhuǎn)錄抑制子,huc O是它的結(jié)合位點(diǎn);Huc R在尿酸的介導(dǎo)下,能夠通過(guò)與huc O結(jié)合或分離,控制、調(diào)控huc O下游基因的表達(dá),sm Uox是一種尿酸酶基因,能夠表達(dá)尿酸酶從而改變尿酸濃度。將sm Uox連入huc O下游,如果環(huán)境中的尿酸濃度過(guò)高,Huc R與huc O解離,sm Uox表達(dá)尿酸酶,降低環(huán)境中的尿酸濃度;當(dāng)該濃度低至某一“臨界值”,Huc R重新連接至huc O位點(diǎn)上,抑制sm Uox的表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)尿酸濃度的穩(wěn)態(tài)控制。在我們前期的研究中,人工優(yōu)化huc R得到優(yōu)化后的轉(zhuǎn)錄抑制子“m UTs”,串聯(lián)huc O得到八串聯(lián)結(jié)構(gòu)“huc O8”,采用瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染的方式將“m UTs”及“huc O8”瞬時(shí)導(dǎo)入細(xì)胞,選用分泌型堿性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase,SEAP)作為報(bào)告基因,構(gòu)建了雙載體尿酸感應(yīng)回路;將“m UTs”,“huc O8”以及報(bào)告基因整合至單向載體上構(gòu)建了單載體尿酸感應(yīng)回路;實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,兩種尿酸感應(yīng)回路均能夠感應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境當(dāng)中尿酸濃度的變化(0-2000μM),并且在一定范圍內(nèi),不同理論比例的m UTs/huc O8能夠影響回路的效果。本研究旨在利用合成生物學(xué)的理念構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系,實(shí)現(xiàn)回路對(duì)尿酸的長(zhǎng)期穩(wěn)定感應(yīng)。另一方面,在穩(wěn)定細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)回路對(duì)尿酸的長(zhǎng)期穩(wěn)定的調(diào)控,能夠迅速調(diào)控尿酸濃度至正常生理值范圍(90-420μM)。主要研究?jī)?nèi)容,方法及結(jié)果如下:1、構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系p-Huc O8-SEAP-m UTs,通過(guò)q PCR檢測(cè)m UTs的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示,穩(wěn)定細(xì)胞系的m UTs相對(duì)表達(dá)量提高了21.8±2.6倍,而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系m UTs相對(duì)表達(dá)量?jī)H升高了3.7±0.15倍。穩(wěn)定細(xì)胞系經(jīng)過(guò)2、4、6、8、10代培養(yǎng)后m UTs相對(duì)表達(dá)量可保持在17.64±2.58倍,說(shuō)明穩(wěn)定細(xì)胞系p-Huc O8-SEAP-m UTs構(gòu)建成功且穩(wěn)定性良好;2、檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞系在0-800μM尿酸濃度條件下SEAP的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果顯示穩(wěn)定細(xì)胞系中SEAP的相對(duì)表達(dá)量隨著尿酸濃度的升高而逐步升高,最高達(dá)到對(duì)照細(xì)胞系的2.8±0.21倍(800μM);在穩(wěn)定細(xì)胞系培養(yǎng)過(guò)程中,每隔24h改變環(huán)境中的尿酸濃度并檢測(cè)SEAP相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果表明,SEAP的相對(duì)表達(dá)量能夠特異地反映培養(yǎng)環(huán)境中尿酸的濃度且可逆性良好。3、在穩(wěn)定細(xì)胞系培養(yǎng)過(guò)程中,每隔24 h改變環(huán)境中的尿酸濃度(0?800),SEAP相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)結(jié)果顯示,SEAP的相對(duì)表達(dá)量能夠特異地反映培養(yǎng)環(huán)境中尿酸的濃度,不受之前環(huán)境中尿酸濃度的影響。結(jié)果表明,該穩(wěn)定細(xì)胞系可用于尿酸濃度的重復(fù)檢測(cè),實(shí)現(xiàn)了回路在細(xì)胞水平上對(duì)尿酸的穩(wěn)態(tài)感應(yīng)。4、選擇sm Uox為下游基因,構(gòu)建載體p-Huc O8-sm Uox-m UTs,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞,構(gòu)建單載體尿酸調(diào)控回路,檢測(cè)其對(duì)培養(yǎng)環(huán)境中尿酸濃度的調(diào)控作用。結(jié)果顯示,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)尿酸具有調(diào)控作用,能在24 h內(nèi)將800μM尿酸降至573.06±8.59μM。5、采用p-huc O8-sm Uox,pc DNA3.1/V5-m UTs,共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,檢測(cè)其對(duì)培養(yǎng)環(huán)境中尿酸的調(diào)控作用。結(jié)果顯示,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)24h后對(duì)較高濃度尿酸(600/800μM)具有顯著的調(diào)控作用,可降低尿酸濃度至(441±0.37/635±1.29μM)但無(wú)法將其降至正常生理值范圍內(nèi)。6、以載體p-huc O8-sm Uox為基礎(chǔ),利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建得到3株穩(wěn)定細(xì)胞系p-Huc O8-sm Uox(C3,D3,D4)。進(jìn)一步瞬時(shí)轉(zhuǎn)染載體p LV-m UTs-m Cherry,考察瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定株調(diào)控尿酸濃度水平的差異。結(jié)果顯示,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的穩(wěn)定株Trans-C3相較于穩(wěn)定株Trans-D3,Trans-D4調(diào)控尿酸濃度水平較優(yōu),能在24 h內(nèi)將800μM尿酸調(diào)整至395.4±0.37μM,落在正常生理值范圍內(nèi)。
【關(guān)鍵詞】：尿酸 穩(wěn)定細(xì)胞系 合成生物學(xué)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R318
【目錄】：

• 英文縮略詞表5-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-13
• 第一章 前言13-19
• 1.1 合成生物學(xué)發(fā)展概述13-14
• 1.2 合成生物學(xué)在構(gòu)建基因回路中的進(jìn)展14-15
• 1.3 基因回路在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用15-16
• 1.4 立題依據(jù)及前期研究結(jié)果16
• 1.5 擬解決的科學(xué)問(wèn)題16-17
• 1.6 研究思路及方法17
• 1.7 理論意義及實(shí)用價(jià)值17-19
• 第二章 重組載體p-HucO8-SEAP-mUTs的構(gòu)建與鑒定19-26
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料19-20
• 2.2 方法20-22
• 2.3 結(jié)果22-25
• 2.4 小結(jié)25-26
• 第三章 穩(wěn)定細(xì)胞系p-HucO8-SEAP-mUTs的構(gòu)建與鑒定26-34
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料26-27
• 3.2 方法27-29
• 3.3 結(jié)果29-33
• 3.4 小結(jié)33-34
• 第四章 重組載體p-HucO8-smUox-mUTs的構(gòu)建與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染34-42
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料34-35
• 4.2 方法35-37
• 4.3 結(jié)果37-41
• 4.4 小結(jié)41-42
• 第五章 雙載體尿酸調(diào)控回路的構(gòu)建與鑒定42-47
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料42-43
• 5.2 方法43
• 5.3 結(jié)果43-46
• 5.4 小結(jié)46-47
• 第六章 穩(wěn)定細(xì)胞系回路p-HucO8-smUox的構(gòu)建47-55
• 6.1 實(shí)驗(yàn)材料47-48
• 6.2 方法48-50
• 6.3 結(jié)果50-54
• 6.4 小結(jié)54-55
• 第七章 調(diào)控尿酸濃度穩(wěn)定株的篩選55-61
• 7.1 實(shí)驗(yàn)材料55-56
• 7.2 方法56-57
• 7.3 結(jié)果57-60
• 7.4 小結(jié)60-61
• 討論與結(jié)論61-63
• 結(jié)論61
• 討論61-63
• 參考文獻(xiàn)63-66
• 攻讀碩士期間發(fā)表文章66-67
• 致謝67

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 凌婧怡;具有感應(yīng)、調(diào)控尿酸濃度功能的穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選與鑒定[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2016年

2 宋青青;不同尿酸濃度對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成神經(jīng)分化的影響[D];青島大學(xué);2014年

3 田應(yīng)鴻;納米粒子增強(qiáng)的近紅外SPR尿酸濃度的檢測(cè)[D];武漢理工大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：620488