本文關鍵詞：原花青素交聯(lián)彈性蛋白的性能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目前,心血管疾病的發(fā)病率和致死率在所有疾病中位列第一,因此對用于心血管疾病治療的人工心臟瓣膜和血管替代品的需求很大。臨床上采用戊二醛(Glutaraldehyde, GA)作為交聯(lián)劑制備得到的心臟瓣膜以及血管雖然具有一定的抗菌、抗炎功能。但是也存在一些嚴重的缺陷,例如：柔軟程度不夠,容易鈣化和不易再細胞化等。因此,迫切需要尋找新的交聯(lián)方法以克服GA交聯(lián)所造成的缺點。 原花青素(procyanidins, PC)是紅酒、水果和蔬菜中的黃酮類多酚,具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗血栓等功效。此外,與一些有毒的化學交聯(lián)劑相比,PC沒有急性和亞急性毒性,其體內(nèi)代謝途徑清楚。前期本實驗室己證明PC通過多酚羥基與脫細胞心臟瓣膜ECM的脯氨酸之間形成氫鍵交聯(lián),并且在1mg/mL時就能夠有效抑制瓣膜ECM鈣化。研究顯示pH中性環(huán)境下,PC既能與彈性蛋白結合又能與膠原蛋白結合形成氫鍵,隨著pH值的下降,其逐漸轉(zhuǎn)向主要與彈性蛋白的結合。而彈性蛋白又是脫細胞瓣膜良好彈性的保障,是維持其柔順性的關鍵,能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的黏附生長以及平滑肌細胞向內(nèi)長入,也是ECM鈣化的起始位點。因此本研究就柔順性、抗鈣化和再細胞化三個主要方面,對PC最佳交聯(lián)條件進行詳細探究,并且針對PC交聯(lián)純彈性蛋白的鈣化抑制效果、抗鈣化機理以及具體作用靶點進行深入探討。 采用PC在不同酸性條件下交聯(lián)脫細胞心臟瓣膜,以期尋找最佳交聯(lián)條件,從而保持脫細胞瓣膜的柔順度、抑制鈣化并同時保持良好的生物相容性。結果顯示,pH6.0交聯(lián)條件下制備的脫細胞心臟瓣膜能夠維持瓣膜的天然形態(tài),顯示出類似于天然脫細胞瓣膜的柔順程度及其他力學性能；能有效抑制瓣膜ECM的鈣化；具有良好的細胞相容性和抗血栓性能。 采用PC交聯(lián)純的彈性蛋白支架,以期明確PC是否能夠抑制彈性蛋白所引起的鈣化,相應的抗鈣化機理以及具體作用靶點。此外也首次探討了PC交聯(lián)純的彈性蛋白的相關生物學特性,用作組織工程帶瓣管道的可能性。結果顯示,PC能夠抑制由彈性蛋白引起的鈣化,其抗鈣化機制為：PC交聯(lián)降低了基質(zhì)材料的免疫原性,抑制巨噬細胞遷入,抑制MMPs和TNF-a的分泌及活性,從而一方面保護彈性蛋白不被MMPs降解,阻斷鈣化；另一方面,阻斷細胞因成骨分化而引起的鈣化。另外,PC可以通過與彈性蛋白的陰離子氨基酸基團之間進行更充分的氫鍵交聯(lián),從而封閉彈性蛋白中潛在的鈣化成核位點,阻斷鈣化。PC交聯(lián)的彈性蛋白支架具備良好的血液相容性、抗血栓和抗炎潛能,滿足了組織工程帶瓣管道的關鍵要求。具備利于再細胞化的孔隙結構及孔隙率,為組織工程支架,特別是帶瓣管道提供了良好的選擇。 在上述基礎上,采用PC在不同pH條件下交聯(lián)彈性蛋白,以既能抗鈣化,又能使彈性蛋白保持柔軟為指標,篩選PC對彈性蛋白的最佳交聯(lián)條件,從而制備出具有理想柔順度和生物學性能的組織工程支架。結果顯示,1mg/mL PC在弱酸性條件下(pH6.0)能夠更充分地交聯(lián)彈性蛋白組分,獲得更優(yōu)柔順度的彈性蛋白支架,該支架具有快速再細胞化潛能,良好的血液相容性以及抗鈣化性能。
【關鍵詞】：原花青素 彈性蛋白 交聯(lián) 柔順性 再細胞化 抗鈣化
【學位授予單位】：華東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R318.08
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-15
• 第一章 原花青素在酸性條件下交聯(lián)制備脫細胞心臟瓣膜的柔順度、抗鈣化及相容性15-36
• 引言15-16
• 1 材料與試劑16-17
• 1.1 材料16
• 1.2 試劑16-17
• 1.3 儀器17
• 2 實驗方法17-21
• 2.1 脫細胞心臟瓣膜的制備及PC交聯(lián)17-18
• 2.2 柔順度測定18
• 2.2.1 交聯(lián)脫細胞瓣膜的宏觀形貌和彎曲角(a)的統(tǒng)計分析18
• 2.2.2 拉伸強度和彈性模量測定18
• 2.3 體外抗鈣化能力測定18-19
• 2.3.1 掃描電鏡下能譜測定18-19
• 2.3.2 電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜定量測定鈣磷含量19
• 2.4 交聯(lián)脫細胞瓣膜的生物相容性檢測19-21
• 2.4.1 Ⅱ型膠原蛋白酶體外降解實驗19
• 2.4.2 細胞黏附實驗19-20
• 2.4.3 血液相容性測定20-21
• 2.5 統(tǒng)計分析21
• 3 實驗結果21-28
• 3.1 脫細胞及交聯(lián)后瓣膜的宏觀形貌和柔順度21-24
• 3.2 交聯(lián)脫細胞瓣膜的體外抗鈣化能力24-25
• 3.3 交聯(lián)脫細胞瓣膜的生物相容性25-28
• 3.3.1 體外Ⅱ型膠原蛋白酶降解穩(wěn)定性25-26
• 3.3.2 瓣膜間質(zhì)細胞黏附26-27
• 3.3.3 血液相容性27-28
• 4 討論28-31
• 5 結論31-32
• 參考文獻32-36
• 第二章 原花青素交聯(lián)彈性蛋白：抗鈣化及相關生物學性能36-69
• 引言36-37
• 1 材料與試劑37-39
• 1.1 材料37
• 1.2 試劑37-38
• 1.3 儀器38-39
• 2 實驗方法39-45
• 2.1 主動脈彈性蛋白的制備39
• 2.2 組織學分析以及掃描電鏡(SEM)觀察39-40
• 2.3 PC交聯(lián)40
• 2.4 交聯(lián)彈性蛋白支架的孔隙率及孔徑分布測定40
• 2.5 抗鈣化及其機理研究40-43
• 2.5.1 體內(nèi)抗鈣化能力測定40-41
• 2.5.2 體外巨噬細胞黏附及TNF-α分泌41
• 2.5.3 MMP-12免疫組化染色41-42
• 2.5.4 抗彈性蛋白酶(MMP-12)體外降解42
• 2.5.5 體外鈣鹽沉積測定42-43
• 2.6 細胞相容性43
• 2.6.1 體外細胞黏附43
• 2.6.2 體內(nèi)再細胞化43
• 2.7 血液相容性43-44
• 2.7.1 抗凝血實驗43-44
• 2.7.2 血小板黏附實驗44
• 2.7.3 溶血實驗44
• 2.8 統(tǒng)計分析44-45
• 3 實驗結果45-59
• 3.1 交聯(lián)主動脈彈性蛋白形貌及孔隙率、孔徑分布45-47
• 3.2 交聯(lián)主動脈彈性蛋白抗鈣化及其機理47-54
• 3.2.1 體內(nèi)抗鈣化能力測定47-49
• 3.2.2 抗巨噬細胞黏附及TNF-a分泌49-51
• 3.2.3 抗MMP-12分泌51-52
• 3.2.4 抗彈性蛋白酶(MMP-12)體外降解52
• 3.2.5 體外鈣化分析52-54
• 3.3 細胞相容性54-56
• 3.3.1 體外細胞黏附54-55
• 3.3.2 體內(nèi)再細胞化55-56
• 3.4 血液相容性56-59
• 3.4.1 抗凝血實驗56-57
• 3.4.2 血小板黏附實驗57-58
• 3.4.3 溶血實驗58-59
• 4 討論59-63
• 5 結論63-64
• 參考文獻64-69
• 第三章 不同PH條件下原花青素交聯(lián)彈性蛋白支架的研究69-95
• 引言69-70
• 1 材料與試劑70-72
• 1.1 材料70
• 1.2 試劑70-71
• 1.3 儀器71-72
• 2 實驗方法72-75
• 2.1 主動脈彈性蛋白支架的制備及形貌分析72
• 2.2 PC交聯(lián)72
• 2.3 彈性模量及柔順度測定72-73
• 2.4 交聯(lián)穩(wěn)定性測試73
• 2.5 細胞相容性73-74
• 2.5.1 體外細胞黏附73
• 2.5.2 體內(nèi)再細胞化73-74
• 2.6 血液相容性74
• 2.7 體內(nèi)外抗鈣化能力分析74-75
• 2.7.1 體內(nèi)抗鈣化能力測定74
• 2.7.2 體外抗鈣化能力測定74-75
• 2.8 統(tǒng)計分析75
• 3 實驗結果75-88
• 3.1 交聯(lián)主動脈彈性蛋白的微觀形貌75-76
• 3.2 PH值對交聯(lián)彈性蛋白彈性模量的影響76-77
• 3.3 PC交聯(lián)穩(wěn)定性77-78
• 3.4 細胞相容性78-82
• 3.4.1 體外細胞黏附78-81
• 3.4.2 體內(nèi)再細胞化81-82
• 3.5 血液相容性82-84
• 3.6 體內(nèi)外抗鈣化能力分析84-88
• 3.6.1 體內(nèi)抗鈣化效應84-86
• 3.6.2 體外抗鈣化效應86-88
• 4 討論88-90
• 5 結論90-91
• 參考文獻91-95
• 第四章 文獻綜述95-110
• 參考文獻100-110
• 附錄110-111
• 致謝111-112

【共引文獻】

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本文編號：504692