本文關(guān)鍵詞：三種方法制備豬小腸黏膜下層細(xì)胞外基質(zhì)的對(duì)比研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的 生物材料屬天然細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，經(jīng)過(guò)機(jī)械法、化學(xué)法、酶學(xué)法等方法，除去原組織中的DNA及細(xì)胞，再通過(guò)交聯(lián)、消毒等處理后制備而成，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，且低免疫原性。以P-SIS為例，其結(jié)構(gòu)絕大多數(shù)為I型和III型膠原纖維，含量超過(guò)90%。P-SIS在保留一定機(jī)械強(qiáng)度的條件下，還包含多種細(xì)胞因子，如基本成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Basic fibroblast growthfactor,bFGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（Transforminggrowth factor,TGF）、表皮生長(zhǎng)因子（Epidermal growth factor,EGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（Insulin-like growthfactor-1,IGF-1)以及葡糖氨基聚糖類(lèi)、纖連蛋白類(lèi)、軟骨素、透明質(zhì)酸，這些成分對(duì)組織重塑和傷口愈合起重要作用[1-2]。P-SIS已經(jīng)廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如肌腱重建、下泌尿道重建、硬腦膜修補(bǔ)、血管重建、修復(fù)部分或全層皮膚損傷[3-5]。生物材料除了擁有與合成材料一樣的疝修補(bǔ)低復(fù)發(fā)率，同時(shí)在生物相容性、抗粘連性等方面也較人工合成材料更為理想，術(shù)后疝復(fù)發(fā)、腹腔感染，腸梗阻、瘺形成等不良反應(yīng)的發(fā)生率明顯較低[6]。 細(xì)胞外基質(zhì)雖有以上所述的種種優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)于某一種ECM的制備方法卻沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)；由于各種ECM結(jié)構(gòu)差異較大，應(yīng)用相同脫細(xì)胞方法較難達(dá)到理想結(jié)果。目前常用的脫細(xì)胞方法主要分為三大類(lèi)：物理方法、化學(xué)方法和消化酶學(xué)方法。如果應(yīng)用的試劑劑量過(guò)小，可使細(xì)胞成分殘留較多，植入機(jī)體后易引起機(jī)體免疫排斥反應(yīng)，局部組織粘連嚴(yán)重、組織包裹鈣化等；若應(yīng)用大劑量試劑，能將細(xì)胞除去干凈，又同時(shí)會(huì)對(duì)ECM本身結(jié)構(gòu)造成損傷[7]。因此，如何較徹底清除ECM中的細(xì)胞和DNA成分，并盡可能減少對(duì)ECM組織結(jié)構(gòu)的破壞，保持其原有的生物活性、力學(xué)特性，是當(dāng)今脫細(xì)胞處理方法的研究熱點(diǎn)。 本實(shí)驗(yàn)小組擬在以上研究基礎(chǔ)上，系統(tǒng)比較三種不同方法制備豬小腸粘膜下層（P-SIS）的體外單軸力學(xué)抗拉力、DNA濃度測(cè)定、生長(zhǎng)因子含量的測(cè)定、及切片染色等結(jié)果，并用三種不同方法制備的P-SIS對(duì)大鼠腹壁部分缺損進(jìn)行修復(fù)，觀察修復(fù)后區(qū)域抗張力、修復(fù)后局部及全身的免疫原性等情況，明確三種不同方法制備P-SIS的差異，為尋找優(yōu)良的制備方法提供依據(jù)。綜合分析三種不同方法制備P-SIS修復(fù)后大鼠腹壁缺損效果，為選擇良好的制備方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法 三種方法制備豬小腸黏膜下層：取4h內(nèi)市售新鮮豬空腸，分別采用機(jī)械法脫細(xì)胞、酸堿法脫細(xì)胞、SDS法脫細(xì)胞，，制備P-SIS生物補(bǔ)片。每步操作后留取樣品（n=10），分別作為A、B、C組；以新鮮豬空腸作為對(duì)照。 動(dòng)物體外測(cè)試：①將三種方法制備好的材料分別進(jìn)行材料單軸力學(xué)測(cè)試（由上海同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物力學(xué)測(cè)試實(shí)驗(yàn)室協(xié)助完成），②采用HE染色、Masson染色、天狼猩紅染色、PAS染色（由上海長(zhǎng)征醫(yī)院病理科協(xié)助完成）、DNA凝膠電泳等實(shí)驗(yàn)方法明確不同方法制備P-SIS的細(xì)胞或DNA含量；③采用Elisa方法檢測(cè)生長(zhǎng)因子VEGF、TGFβ1的殘余量。 動(dòng)物體內(nèi)測(cè)試和評(píng)估：分別用三種不同方法制備的P-SIS修補(bǔ)大鼠腹壁部分缺損模型，通過(guò)腹腔注水實(shí)驗(yàn)、修補(bǔ)區(qū)域免疫組化測(cè)定炎性細(xì)胞、Ellisa方法測(cè)定炎性介質(zhì)等方法，評(píng)價(jià)其各組術(shù)后抗張力及免疫炎癥反應(yīng)。 研究結(jié)果 1、動(dòng)物體外測(cè)試：通過(guò)單軸力學(xué)拉伸實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，酸堿組制備的P-SIS拉伸強(qiáng)度、最大伸長(zhǎng)率優(yōu)于SDS組和機(jī)械組（P0.05）；通過(guò)各種染色、及DNA濃度測(cè)定可以得出，酸堿組DNA含量明顯低于其他兩組（P0.05），且酸堿組彈性纖維結(jié)構(gòu)排列整齊，而SDS組彈性纖維結(jié)構(gòu)松散、部分纖維已出現(xiàn)斷裂；通過(guò)Ellisa方法測(cè)定生長(zhǎng)因子TGF-β、VEGF含量得出，酸堿組生長(zhǎng)因子含量較SDS組高（P0.05）。 2、動(dòng)物體內(nèi)測(cè)試和評(píng)估：術(shù)后36只SD大鼠均存活，無(wú)明顯感染、血腫及腹壁疝形成等情況，腹壁部分缺損修復(fù)完整。通過(guò)對(duì)三組術(shù)后8周大鼠進(jìn)行腹腔注水試驗(yàn)，均未見(jiàn)修補(bǔ)區(qū)域膨出、腹壁疝形成（P0.05）；通過(guò)Ellisa方法測(cè)定血清中IL-6、TNF-α含量的結(jié)果得出，酸堿法制備的P-SIS植入動(dòng)物體內(nèi)后，IL-6、TNF-α含量均較SDS組和機(jī)械組低（P0.05）；通過(guò)免疫組化檢測(cè)局部修復(fù)區(qū)炎性細(xì)胞含、內(nèi)皮增生細(xì)胞含量，得出結(jié)論，酸堿組結(jié)果總體優(yōu)于SDS組和機(jī)械組（P0.05）。 結(jié)論 在三種不同方法制備的P-SIS中，酸堿法制備的P-SIS在力學(xué)特性、生長(zhǎng)因子含量、殘余DNA濃度測(cè)定方面均優(yōu)于機(jī)械法和SDS法制備的P-SIS。植入機(jī)體后，酸堿組抗張力無(wú)明顯降低，且在引起機(jī)體免疫反應(yīng)、內(nèi)皮增生細(xì)胞含量測(cè)定方面，酸堿組優(yōu)于其他兩組，綜上所述，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為酸堿法在三種方法中最優(yōu)。
【關(guān)鍵詞】：豬小腸黏膜下層 脫細(xì)胞處理 腹壁部分缺損 機(jī)械法 酸堿法 SDS法生長(zhǎng)因子 免疫組化
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R318.08;R656.7
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 縮略詞表10-11
• 前言11-14
• 第一部分 三種方法豬小腸黏膜下層細(xì)胞外基質(zhì)的制備及其體外性能測(cè)試14-30
• 一、三種方法豬小腸黏膜下層生物材料的制備15-17
• 二、三種方法制備的 P-SIS 材料體外測(cè)試17-27
• 三、討論27-30
• 第二部分 三種方法制備的豬小腸黏膜下層細(xì)胞外基質(zhì)修復(fù)大鼠腹壁部分缺損后效果比較分析30-45
• 一、動(dòng)物模型的制備30-32
• 二、三種方法制備的 P-SIS 修復(fù)大鼠腹壁部分缺損效果比較分析32-41
• 三、討論41-45
• 全文總結(jié)45-46
• 綜述46-50
• 參考文獻(xiàn)50-55
• 附錄一55-56
• 附錄二56-57
• 致謝57

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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本文編號(hào)：490022