本文關(guān)鍵詞：通過檢測(cè)堿性磷酸酶和骨鈣素2的表達(dá)水平定量分析組織工程骨成骨影響因素，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：大塊骨損傷是目前重建手術(shù)的巨大挑戰(zhàn)。目前,臨床上常用的治療方法包括自體骨移植,異體骨移植和人工材料單獨(dú)或結(jié)合骨移植。然而,自體骨移植材料來源有限且可導(dǎo)致供體損傷。異體骨移植有導(dǎo)致免疫反應(yīng)、疾病傳播和炎癥的風(fēng)險(xiǎn)。近年來組織工程骨技術(shù)治療骨缺損的研究吸引了人們的注意。組織工程骨技術(shù)有三個(gè)關(guān)鍵元素：(1)細(xì)胞(2)生長(zhǎng)因子(3)支架。同時(shí),組織工程骨的生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)成骨也有很大的影響。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種可以分化為成骨細(xì)胞,脂肪細(xì)胞,肌腱細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的多能干細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以在骨髓提取并在體外迅速擴(kuò)增,因此被廣泛用做種子細(xì)胞。富血小板血漿富含可以影響骨再生的生長(zhǎng)因子。當(dāng)被激動(dòng)劑例如凝血酶激活時(shí),富血小板血漿可以釋放這些細(xì)胞因子。支架材料在組織工程骨技術(shù)中有關(guān)鍵性的作用,β—磷酸三鈣生物支架材料具有高生物相容性,良好的生物可吸收性和可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化增殖等優(yōu)點(diǎn)。灌注型生物反應(yīng)器可以模擬生物內(nèi)環(huán)境和創(chuàng)建一個(gè)三維立體空間,來促進(jìn)細(xì)胞的粘附、增殖和分化。成骨分化早期的重要參考指數(shù)為ALP的表達(dá)水平。此外,ALP在骨的鈣化過程中起著十分重要的作用,常被認(rèn)為是成熟的成骨細(xì)胞的標(biāo)志性酶。在體外成骨試驗(yàn)中,ALP濃度的定量檢測(cè)常被用作早期成骨份化的常規(guī)性標(biāo)志物。Bglap2作為成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志物,主要在骨細(xì)胞鈣化期出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用灌注型生物反應(yīng)器,利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和β—磷酸三鈣生物材料支架在體外構(gòu)建組織工程骨,并利用富血小板血漿作為成骨誘導(dǎo)中生長(zhǎng)因子的來源,將以上因素相互組合成不同實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,植入兔皮下,通過檢測(cè)不同組合構(gòu)建的復(fù)合體其ALP和Bglap2的表達(dá)水平,評(píng)估以上各因素在組織工程骨成骨中的促進(jìn)作用。方法1.取2-3月齡的健康的新西蘭大白兔,麻醉好后放于實(shí)驗(yàn)臺(tái),備皮,固定,消毒,鋪無菌巾,在無菌條件下用穿刺針抽取雙側(cè)脛骨平臺(tái)內(nèi)下側(cè)骨髓5ml,梯度密度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,進(jìn)行原代、傳代細(xì)胞培養(yǎng)。流式細(xì)胞儀鑒定。2.制備富血小板血漿。經(jīng)兔耳緣靜脈抽取新鮮血液約5ml,在無菌條件下,迅速加入到盛有1ml 5%枸櫞酸鈉的10ml離心管中,輕輕搖晃,防止凝固。將上述離心管中的血液放入離心機(jī)中,采用二次離心法制備富血小板血漿,第一次離心3300rpm,第二次離心3000rpm,然后得到無色透明的膠凍狀物質(zhì)即是富血小板血漿。3.將第三代兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液,將制備的細(xì)胞懸液滴加到β—磷酸三鈣支架材料上,上下翻轉(zhuǎn)支架材料,這樣可以使支架材料的每部分都有細(xì)胞接觸,滴加好細(xì)胞懸液后,向每個(gè)培養(yǎng)孔板中追加3ml的細(xì)胞培養(yǎng)基,放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),過夜。將上述制備的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與β—磷酸三鈣(β-TCP)支架復(fù)合體置入含有或不含有富血小板血漿的生物反應(yīng)器灌注柱內(nèi),最后,將生物反應(yīng)器整套系統(tǒng)置入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)3周。放置好后調(diào)節(jié)流速為3ml/min,沒2-3天換一次培養(yǎng)液。電鏡下觀察生物支架及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附、增殖和生長(zhǎng)。我們將構(gòu)建的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合支架材料分成五組：A組：富血小板血漿+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞+β-磷酸三鈣+生物反應(yīng)器B組：富血小板血漿+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞+β-磷酸三鈣C組：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞+β-磷酸三鈣+生物反應(yīng)器D組：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞+β—磷酸三鈣E組：β—磷酸三鈣。4.將在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的復(fù)合體取出,植入到大白兔腰部的深淺筋膜之間,縫合,并記錄其位置,三個(gè)月以后,處死大白兔取出復(fù)合體材料,將復(fù)合體材料上的細(xì)胞分離并進(jìn)行定量PCR以檢測(cè)細(xì)胞中骨鈣素和堿性磷酸酶的表達(dá)。5.定量PCR重復(fù)三次。所得計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,數(shù)據(jù)使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行各組之間的單因素方差分析或t檢驗(yàn),P0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.使用倒置相差顯微鏡鏡下觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可見接種后3天出現(xiàn)少量細(xì)胞粘附貼壁,此時(shí)細(xì)胞呈現(xiàn)梭形。培養(yǎng)7天后觀察到細(xì)胞集落的出現(xiàn),傳代培養(yǎng)7天后觀察到細(xì)胞形成漩渦狀集落。2.使用流式細(xì)胞儀對(duì)經(jīng)過2次傳代后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定,結(jié)果示2%的細(xì)胞為CD34陽性,98%的細(xì)胞為CD44陽性。3.電鏡下可見骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在三維支架材料上良好的粘附和分布。4.實(shí)驗(yàn)組因骨鈣素2(BGLAP2)、堿性磷酸酶(ALP)基因的表達(dá)明顯高于其他組。實(shí)驗(yàn)組之間的比較也表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是組織工程中較理想的種子細(xì)胞。2.自體富血小板血漿能夠有效誘導(dǎo)成骨。3.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞適合于在β—磷酸三鈣(β-TCP)支架材料上黏附和增殖。4.生物反應(yīng)器可以提供促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)和分化的三維立體環(huán)境從而促進(jìn)骨的生成。
【關(guān)鍵詞】：骨缺損 β-TCP支架 生物反應(yīng)器 富血小板血漿 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R687.3;R318.08
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 英文縮寫及符號(hào)說明13-15
• 前言15-19
• 材料與方法19-21
• 試驗(yàn)方法21-34
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-35
• 討論35-38
• 附圖38-41
• 參考文獻(xiàn)41-44
• 致謝44-45
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄45-46
• 附件46

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 楊志明;組織工程骨的研究成果及存在的問題[J];中國修復(fù)重建外科雜志;2005年02期

2 張?jiān)?,崔繼秀 ,裴國獻(xiàn) ,王永剛 ,金丹 ,秦煜 ,陳濱 ,魏寬海;神經(jīng)化組織工程骨構(gòu)建的初步觀察[J];中華創(chuàng)傷骨科雜志;2005年01期

3 藍(lán)旭;梁軍;葛寶豐;劉雪梅;;不同凍存方法對(duì)組織工程骨生物活性的影響[J];中國美容醫(yī)學(xué);2007年02期

4 劉杰;許建中;劉曦明;羅飛;何清義;代飛;謝肇;;個(gè)體化組織工程骨成骨機(jī)制探討[J];華南國防醫(yī)學(xué)雜志;2008年02期

5 劉勇;裴國獻(xiàn);江汕;任高宏;梁雙武;趙培冉;;組織工程骨神經(jīng)化構(gòu)建的影像學(xué)研究[J];實(shí)用醫(yī)藥雜志;2008年05期

6 劉勇;裴國獻(xiàn);江汕;姚旺祥;任高宏;孫新君;;組織工程骨神經(jīng)化構(gòu)建的組織學(xué)研究[J];中國矯形外科雜志;2009年16期

7 蔡升勇;習(xí)俊通;;基于形函數(shù)控制的組織工程骨架孔隙結(jié)構(gòu)實(shí)體建模方法[J];機(jī)械工程學(xué)報(bào);2009年07期

8 毛天球,楊維東,陳富林,陶凱;組織工程骨的研究[J];中國修復(fù)重建外科雜志;2003年02期

9 李智;組織工程骨血管再生的研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊(cè);2003年06期

10 宋晉剛,許建中;脈沖電磁場(chǎng)在組織工程骨培養(yǎng)中的研究與進(jìn)展[J];中國臨床康復(fù);2004年14期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳學(xué)忠;張西正;李志宏;;組織工程骨的構(gòu)建策略及存在的問題(綜述)[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第30次學(xué)術(shù)年會(huì)暨生物醫(yī)學(xué)工程前沿科學(xué)研討會(huì)論文集[C];2010年

2 鄧力;楊志明;智偉;解慧琪;羅靜聰;李秀群;劉天慶;宋克東;;旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器構(gòu)建組織工程骨[A];2005'中國修復(fù)重建外科論壇論文匯編[C];2005年

3 馬全美;田曉紅;柏樹令;;組織工程骨膜的研究進(jìn)展[A];2008年中國解剖學(xué)會(huì)第十一屆教學(xué)改革研討會(huì)論文集[C];2008年

4 陳槐卿;周江;唐戎;周大利;;骨髓基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合種植構(gòu)造組織工程骨的初步研究[A];中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第六次會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2004年

5 宋克東;劉天慶;李香琴;葛丹;孫相玉;馬學(xué)虎;崔占峰;;新型旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器內(nèi)三維組織工程骨的構(gòu)建[A];第一屆全國化學(xué)工程與生物化工年會(huì)論文摘要集(下)[C];2004年

6 何大為;金巖;;水凝膠、陶瓷類材料以及生長(zhǎng)因子的復(fù)合對(duì)組織工程骨的影響[A];加入WTO和中國科技與可持續(xù)發(fā)展——挑戰(zhàn)與機(jī)遇、責(zé)任和對(duì)策（下冊(cè)）[C];2002年

7 羅曉中;楊志明;鄧力;李秀群;;低溫保存的組織工程骨修復(fù)骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究[A];2005'中國修復(fù)重建外科論壇論文匯編[C];2005年

8 李欣;黃國英;崔艾萍;;組織工程骨移植修復(fù)骨缺損的手術(shù)配合[A];中華護(hù)理學(xué)會(huì)第14屆全國手術(shù)室護(hù)理學(xué)術(shù)交流會(huì)議論文匯編（上冊(cè)）[C];2010年

9 連輝;柏樹令;田曉紅;佟浩;;組織工程骨血管化策略研究現(xiàn)狀[A];2008年中國解剖學(xué)會(huì)第十一屆教學(xué)改革研討會(huì)論文集[C];2008年

10 張開剛;曾炳芳;張長(zhǎng)青;;小腸粘膜下層為支架材料構(gòu)建組織工程骨膜成骨的血管化超微結(jié)構(gòu)觀察[A];2005年上海市醫(yī)用生物材料研討會(huì)論文匯編[C];2005年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 蔣銳;我國組織工程骨應(yīng)用研究獲成果[N];中國醫(yī)藥報(bào);2006年

2 鄒爭(zhēng)春　劉蘋 記者 趙雪;我科學(xué)家解決組織工程骨血液循環(huán)障礙國際難題[N];科技日?qǐng)?bào);2011年

3 熊艷;用組織工程骨替代缺損肋骨[N];中國醫(yī)藥報(bào);2000年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 蔣佳;雙基因修飾組織工程骨的構(gòu)建及其成骨的研究[D];上海交通大學(xué);2008年

2 解芳;構(gòu)建同種異體組織工程骨及修復(fù)犬顱骨臨界骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

3 江汕;組織工程骨原位構(gòu)建修復(fù)股骨缺損的示蹤研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

4 馬東洋;基于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建無外支架組織工程骨的實(shí)驗(yàn)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2010年

5 羅曉中;組織工程骨低溫保存的實(shí)驗(yàn)研究[D];四川大學(xué);2005年

6 羅飛;模擬微重力生物反應(yīng)器制備組織工程骨的實(shí)驗(yàn)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2007年

7 鄧天政;組織工程骨—軟骨復(fù)合組織的構(gòu)建及體內(nèi)外形態(tài)學(xué)觀察的實(shí)驗(yàn)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2008年

8 常正奇;富含功能蛋白的凍干組織工程骨的構(gòu)建及成骨效果與成骨機(jī)制的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2014年

9 吳驍偉;不同血管化策略構(gòu)建組織工程骨的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

10 陳學(xué)忠;力學(xué)環(huán)境下組織工程骨的構(gòu)建與動(dòng)態(tài)培養(yǎng)[D];南方醫(yī)科大學(xué);2011年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張聰;hBMP2與hVEGF165雙基因共表達(dá)腺病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs復(fù)合n-HA/PA66組織工程骨構(gòu)建及檢測(cè)[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2015年

2 宋擇眾;通過檢測(cè)堿性磷酸酶和骨鈣素2的表達(dá)水平定量分析組織工程骨成骨影響因素[D];山東大學(xué);2015年

3 蔡升勇;基于形函數(shù)控制的組織工程骨架孔隙分布結(jié)構(gòu)實(shí)體建模技術(shù)研究[D];上海交通大學(xué);2010年

4 張弓;多基因修飾組織工程骨中其基因表達(dá)時(shí)限的檢測(cè)[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2009年

5 劉勇;組織工程骨血管神經(jīng)化構(gòu)建的早期觀察[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2007年

6 穆天旺;血管束、感覺神經(jīng)束植入構(gòu)建組織工程骨血管神經(jīng)化的早期形態(tài)學(xué)觀察[D];南方醫(yī)科大學(xué);2009年

7 拓振合;應(yīng)用組織工程骨膜及其脫蛋白骨輔助支架修復(fù)兔橈骨大段骨缺損[D];蘭州大學(xué);2014年

8 吳治林;個(gè)體化組織工程骨修復(fù)人長(zhǎng)骨缺損的回顧性對(duì)比研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2014年

9 施洪臣;骨膠原凝膠制備及與細(xì)胞—微球復(fù)合構(gòu)建組織工程骨的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2007年

10 劉杰;組織工程骨修復(fù)長(zhǎng)骨缺損實(shí)驗(yàn)與臨床初步研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2005年

  本文關(guān)鍵詞：通過檢測(cè)堿性磷酸酶和骨鈣素2的表達(dá)水平定量分析組織工程骨成骨影響因素，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：426295