本文關鍵詞：體外構建血管化組織工程心肌的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的本研究用5-氮胞苷對獲取的大鼠骨髓間充質干細胞進行誘導，內皮生長培養(yǎng)基MV2（EGM-2MV）對獲取的骨髓源性內皮祖細胞進行誘導，將誘導獲取的心肌細胞、內皮細胞以2:1比例混合種植于Matrigel基質膠上，進行組織工程心肌的血管化，以探索在體外進行血管化組織工程心肌構建的可能性。 方法1骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)及誘導：利用全骨髓貼壁培養(yǎng)的方法分離獲取骨髓間充質干細胞；5-氮胞苷作為誘導劑，對其向心肌細胞進行定向誘導。誘導前后，免疫細胞化學法行細胞鑒定：骨髓間充質干細胞表面標志物CD29、CD44、CD34；心肌細胞表面標志物cTnT。2骨髓源性內皮祖細胞的分離、培養(yǎng)及向內皮細胞的誘導：取3周齡SD大鼠，分離出股骨、脛骨，等量淋巴細胞分層液分離，收集單個核細胞，通過EGM-2MV條件培養(yǎng)基對骨髓源性內皮祖細胞進行培養(yǎng)。通過CD31、CD34和CD133等表面標志物的表達情況對細胞進行鑒定。3體外構建組織工程化心�。簩⒐撬柙葱孕募〖毎肈API標記、骨髓源性內皮細胞用CM-dil標記，實驗組以2:1比例種植于Matrigel基質膠并進行共同培養(yǎng)；對照組以1:0的比例進行種植培養(yǎng)。不同時間點觀察細胞復合體的形態(tài)，免疫熒光顯微鏡下和蘇木精-伊紅染色方法觀察兩種細胞的分布情況并進行心肌細胞凋亡檢測。采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數據分析。計量資料選用均數±標準差（x±s）表示，組間對比采用t檢驗，P值0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結果1骨髓間充質干細胞原代細胞接種后少數細胞貼壁，形狀不規(guī)則，可呈多種形態(tài)，如：紡錘形、不規(guī)則形；之后細胞形態(tài)不斷變化，最終呈集落樣增殖，，細胞呈梭形并以放射狀或者漩渦狀形態(tài)向四周擴增。細胞傳代后，混合雜細胞被清除，骨髓間充質干細胞分布均勻，形態(tài)單一，呈長梭形，且增殖明顯高于原代細胞。骨髓間充質干細胞表面標記物CD29、CD44陽性表達，CD34陰性表達。即胞漿中有棕黃色顆粒為陽性表達，反之為陰性。2P3代骨髓間充質干細胞生長狀況：接種第2天因胰酶消化作用及適應新的生長環(huán)境細胞數稍有減少；第3天開始細胞數有所增長；到了第6天，細胞數明顯開始升高，說明此時細胞處于分裂增殖期；第9天時，細胞數達到最多。3獲取的骨髓間充質干細胞在心肌細胞的定向誘導過程的初期（24h后）部分細胞因5-氮胞苷的毒性作用而死亡，經過1周的藥物誘導后可出現臨近細胞彼此融合；2周后，細胞呈圓柱形或多角形，細胞接觸緊密；4周后，細胞呈梭形，漩渦狀生長。誘導后細胞免疫組織化學染色顯示cTnT陽性表達。通過細胞計數，確定誘導后細胞的陽性率在90%以上。4分離培養(yǎng)的大鼠骨髓源性內皮祖細胞接種后細胞逐漸貼壁，呈小桿狀或梭形等多種形態(tài)。5天時為集落樣生長：中央細胞密集，周圍單層細胞放射狀羅列，2周時多數單層細胞為多角形，融合成片狀，呈所謂“鋪路石樣”外觀。細胞免疫組織化學染色顯示CD31、CD34和CD133陽性表達。通過細胞計數，確定誘導后細胞的陽性率在90%以上。5第3代內皮細胞生長曲線：接種第2天因胰酶消化作用及適應新的生長環(huán)境細胞數未見增多，48小時后貼壁伸展，3天后開始大量增殖，5天后進入對數生長期，細胞數明顯增多，8天以后增長趨勢逐漸減緩，趨于平穩(wěn)。6蘇木精-伊紅染色及熒光顯微鏡顯示心肌內皮細胞/Matrigel基質膠復合體內細胞密度均勻，心肌細胞胞核呈藍色圓形熒光，內皮細胞胞漿呈紅色熒光。7心肌細胞與內皮細胞共培養(yǎng)24h后，2:1組復合體可出現內皮細胞典型的“成血管現象”；1:0組可見細胞均勻生長，卻無“成血管現象”。8TUNEL細胞凋亡檢測顯示2:1組比1:0組的凋亡心肌細胞少。9通過血管計數結果顯示，心肌內皮細胞/Matrigel基質膠組（12±2.69）形成的血管樣結構明顯多于心肌細胞/Matrigel基質膠組（1±0.79）。 結論1骨髓間充質干細胞經5-aza誘導可以獲得陽性率較高的心肌細胞。2等量淋巴細胞分層液分離獲取骨髓源性內皮祖細胞并用EGM-2MV條件培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，可以獲得活性好、陽性率高的骨髓源性內皮細胞。3骨髓源性心肌細胞與骨髓源性內皮細胞以2:1的比例聯合種植于Matrigel基質膠共培養(yǎng)，可于體外成功構建血管化組織工程心肌。
【關鍵詞】：血管化 心肌細胞 內皮細胞 組織工程
【學位授予單位】：河北聯合大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R318.08
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 引言11-13
• 第1章 實驗研究13-41
• 1.1 材料與方法13-20
• 1.1.1 實驗材料13-16
• 1.1.2 實驗方法16-20
• 1.1.3 統(tǒng)計學分析20
• 1.2 結果20-29
• 1.2.1 大鼠 BMSCs 細胞形態(tài)學及表面抗原檢測20-23
• 1.2.2 BMSCs 向心肌細胞誘導23-24
• 1.2.3 骨髓源性內皮祖細胞形態(tài)學及相關抗原檢測24-26
• 1.2.4 細胞/Matrigel 基質膠支架復合體26-27
• 1.2.5 細胞-支架材料復合體成血管能力的檢測27-28
• 1.2.6 TUNEL 細胞凋亡檢測28-29
• 1.3 討論29-36
• 1.3.1 骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)及向心肌細胞的誘導分化30-32
• 1.3.2 骨髓源性內皮祖細胞分離、培養(yǎng)及向內皮細胞的誘導分化32-33
• 1.3.3 支架材料33-34
• 1.3.4 組織工程心肌的血管化34-36
• 1.4 結論36
• 參考文獻36-41
• 第2章 綜述 心肌組織工程的研究進展41-52
• 2.1 心肌組織工程種子細胞來源41-43
• 2.2 心肌組織工程的支架材料43-45
• 2.3 工程化心肌組織的體外構建45-46
• 2.4 工程化心肌組織的再血管化46-47
• 2.5 問題與展望47
• 參考文獻47-52
• 致謝52-53
• 導師簡介53-54
• 作者簡介54-55
• 學位論文數據集55

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前9條

1 武金霞;單彪;習洋;甄興航;張賀迎;;蚯蚓凍干粉的抗氧化作用[J];河北大學學報(自然科學版);2010年01期

2 李舜堯;;胎鼠心肌與肝臟細胞的體外生長特性[J];內蒙古大學學報(自然科學版);2008年04期

3 皮淑芳;王懷禎;李彤;王禹;;干細胞移植與心臟疾病治療[J];生物醫(yī)學工程與臨床;2010年02期

4 汪浩文;何志旭;王志華;劉俊峰;;大鼠骨髓間充質干細胞多向分化潛能的研究[J];復旦學報(醫(yī)學版);2009年05期

5 邢玉潔;呂安林;趙曉梅;李飛;王利;杜娟娟;;心肌組織工程的研究現狀[J];中國組織工程研究與臨床康復;2009年02期

6 伍長學;馬建e

本文編號：384475