角蛋白因其優(yōu)良的生物相容性和可降解性,在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。由于天然角蛋白分子中含有大量的二硫鍵使其溶解性較差,制備可溶性好、分子量可控的角蛋白對(duì)推進(jìn)其生物材料領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。目前常用的物理法和化學(xué)法仍然存在著條件苛刻、試劑用量大和角蛋白分子片段偏小等問題,使材料性能和應(yīng)用領(lǐng)域受到諸多限制。酶法制備可溶性角蛋白條件溫和,過程相對(duì)可控,符合綠色制造的發(fā)展方向。我國是羊毛制品生產(chǎn)大國,在毛紡織物的生產(chǎn)過程中產(chǎn)生了大量的羊毛廢棄物。本研究旨在通過雙酶法,以羊毛為底物制備出大分子可溶性角蛋白,利用靜電紡絲和原位還原方法制備出PHBV/角蛋白/AgNPs納米纖維膜并對(duì)其進(jìn)行表征,初步開展了上述角蛋白基敷料的抑菌性能與促進(jìn)傷口愈合的應(yīng)用研究。論文的主要研究?jī)?nèi)容如下:（1）角蛋白酶的發(fā)酵制備。通過單因素和正交實(shí)驗(yàn),對(duì)培養(yǎng)基的組分和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,得到適宜的產(chǎn)酶條件,其培養(yǎng)基主要成分為蛋白胨14 g·L^-1,酵母提取物28g·L^-1,甘油30 g·L^-1;培養(yǎng)溫度37°C,初始pH為8.0。搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶最高達(dá)到59... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

可溶性角蛋白的生物材料應(yīng)用Fig.1-1Biomaterialapplicationofsolublekeratin

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文4圖1-2角蛋白結(jié)構(gòu)示意及其分子內(nèi)部或肽類之間作用力[38]Fig.1-2Thestructuraldiagramofkeratinanditsintramolecularforces1.2.3可溶性角蛋白的提取為充分利用羊毛角蛋白資源，亟需研究開發(fā)溫和高效的處理加工方法。羊毛中存在的二硫鍵、氫鍵、鹽鍵等使其擁有優(yōu)良的穩(wěn)定性和較低的溶解度，同時(shí)給可溶性角蛋白的制備帶來了一定的困難。如表1-2所示，目前可溶性角蛋白的提取方法包括化學(xué)法、理法和酶法。1.2.3.1化學(xué)法（1）酸法在濃度為6M的鹽酸溶液中投入剪碎的羊毛，在120℃條件下反應(yīng)22h，可以將羊毛水解為氨基酸和分子量在0.3-5kDa之間的多肽溶液。雖然酸法水解率偏高、但是該法所制備的角蛋白分子量不可控。（2）堿法用堿溶液處理羊毛后，二硫鍵斷裂，胱氨酸殘基發(fā)生降解[39]。然而在處理過程中，含硫化學(xué)鍵的分解會(huì)產(chǎn)生具有刺激性氣味硫化氫氣體[40]。堿法降解羊毛的溶解度大，但是生成的蛋白分子量較校對(duì)蛋白質(zhì)主鏈的破壞、堿性試劑的大量消耗以及需要大量的酸來中和廢液是限制堿法制備角蛋白的主要因素。（3）氧化法在氧化劑的作用下，角蛋白中大量的二硫鍵被氧化為磺酸基團(tuán)，從而使不溶性角蛋白可溶。李聞欣等[41]利用氧化劑H2O2在堿性條件下制備出平均分子量為2.5kDa的可溶性角蛋白。奚柏君[42]等利用過氧乙酸在堿性條件下制得分子量為在3-4kDa之間的角蛋白溶液。由于強(qiáng)氧化劑徹底破壞肽鏈結(jié)構(gòu)，制備出的往往是小分子多肽以及氨基酸的混合物，難以應(yīng)用于生物材料領(lǐng)域。（4）還原法與氧化法的原理不同，還原法是將二硫鍵還原為巰基以減小分子間的交聯(lián)程度，從而獲得可溶性角蛋白。如采用巰基化合物等還原劑，可以拆開分子間的二硫鍵獲得具有一定溶解性的角蛋白。為了提高溶解率，通常會(huì)加入尿素以?

橢訃字械?天然角蛋白的產(chǎn)酶菌種主要集中于鏈霉菌屬[72-74]。此外，在自然環(huán)境中，也存在少數(shù)具有角蛋白分解能力的真菌，其分布主要取決于所在環(huán)境是否有角蛋白的存在[75]。產(chǎn)角蛋白酶真菌的研究主要集中于皮膚病真菌如毛癬菌和微孢子蟲對(duì)角蛋白的溶解潛力，這對(duì)醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要意義[75,76]。在非皮膚病菌真菌中，具有良好應(yīng)用特性的真菌有曲霉屬、擬青霉屬、帚霉菌屬和白僵菌屬等。1.3.2角蛋白酶的作用機(jī)制目前角蛋白酶普遍被認(rèn)同的作用機(jī)制為復(fù)合酶解理論，該降解機(jī)理可分為兩個(gè)主要步驟：變性作用和水解作用（圖1-3）。第一步是變性作用：角蛋白酶的二硫鍵還原酶攻擊角蛋白的二硫鍵，將胱氨酸（-S-S-）還原為半胱氨酸（-SH），同時(shí)釋放出巰基，角蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞解體而形成變性角蛋白[77]；第二步是水解作用：經(jīng)過變性作用，角蛋白解體為變性角蛋白，變性角蛋白在多肽酶的催化作用下，逐漸被水解成多肽、寡肽和游離氨基酸[78-79]。圖1-3角蛋白酶的降解機(jī)理Fig.1-3Thecatalyticmechanismofkeratinase1.3.3角蛋白酶的發(fā)酵制備如需真正推動(dòng)角蛋白酶的商業(yè)應(yīng)用，就必須實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)，因此研究角蛋白酶的發(fā)酵條件十分重要。微生物發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的方法主要包含兩種，一是固體發(fā)酵，二是液體深層發(fā)酵。在已有的研究中，絕大部分細(xì)菌都是使用液體深層發(fā)酵進(jìn)行培養(yǎng)來獲得酶蛋白的。研究者主要對(duì)培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件這兩個(gè)方面進(jìn)行研究，探究這兩個(gè)因素對(duì)酶活的影響從而達(dá)到提高酶活的目的。發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化一般是采用正交實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面法等數(shù)學(xué)建模方法對(duì)產(chǎn)酶發(fā)酵各因素對(duì)酶活的影響進(jìn)行分析，從而達(dá)到優(yōu)化目的。Ramnani[80]等利用響應(yīng)面方法優(yōu)化地衣芽孢桿菌RG1的產(chǎn)酶條件，篩選出3個(gè)影響菌體產(chǎn)酶量的顯著因素，并利用方差分析?

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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