本文關(guān)鍵詞：孤雌胚胎干細(xì)胞來源的組織工程皮膚種子細(xì)胞的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：皮膚是人體最大的器官,在保持人體溫度,抵御外界影響中發(fā)揮了重要的作用。創(chuàng)傷、感染、腫瘤切除等造成的皮膚缺損,以及糖尿病、靜脈曲張等引起的皮膚潰瘍是臨床上常見的疾病,損害了病人的身體健康和生活質(zhì)量。傳統(tǒng)的皮膚缺損治療方法主要是自體移植,即從人體的非重要部位切取部分皮膚移植到缺損部位進(jìn)行修復(fù)。自體皮膚移植一方面皮膚來源有限,無法治療大面積皮膚缺損,另一方面開辟第二術(shù)區(qū)會(huì)給患者造成了新的痛苦,并會(huì)導(dǎo)致皮膚供區(qū)的繼發(fā)性畸形。 隨著科學(xué)和技術(shù)手段的發(fā)展,已有越來越多的新方法用于皮膚缺損的治療,組織工程皮膚(Tissue-engineered skin, TES)就是其中一種最有效的治療手段。TES是通過將種子細(xì)胞接種到一定的基質(zhì)材料中形成具有類似皮膚結(jié)構(gòu)的復(fù)合物,植入體內(nèi)以發(fā)揮其皮膚缺損的修復(fù)作用。目前,經(jīng)過FDA批準(zhǔn)的TES,如1997年批準(zhǔn)的Transcyte(?),1998年批準(zhǔn)的Apligraf(?)以及2001年批準(zhǔn)的Dermagraft(?)都已經(jīng)上市銷售。目前使用的TES種子細(xì)胞通常來自于兒童的包皮,來源有限、體外擴(kuò)增需要的時(shí)間較長,難以滿足大量生產(chǎn)的需要。同時(shí)由于種子細(xì)胞來源有限而造成相關(guān)產(chǎn)品的價(jià)格較高,會(huì)給患者帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells, ESCs)是一種有前景的TES種子細(xì)胞的來源,相比于包皮來源的成纖維細(xì)胞,ESCs具有來源不受限、體外擴(kuò)增速度快的優(yōu)點(diǎn),但應(yīng)用時(shí)可能受到倫理學(xué)的限制。孤雌胚胎干細(xì)胞(Parthenogenetic embryonic stem cells, pESCs)來源于人工激活的孤雌囊胚,相對(duì)于正常的ESCs,不破壞活的胚胎,由于只具有母系的遺傳物質(zhì),能大大減弱免疫排斥反應(yīng),因此是一種理想的種子細(xì)胞來源。 人和高等動(dòng)物的皮膚主要由表皮層、真皮層和皮下組織組成,還含有皮膚附屬器官。真皮層中主要細(xì)胞類型是成纖維細(xì)胞。我們的研究思路是先將pESCs擴(kuò)增培養(yǎng),然后懸浮培養(yǎng)形成擬胚體(Embryoid bodies, EBs),隨后讓EBs貼壁,經(jīng)過連續(xù)培養(yǎng)和篩選獲得間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cell, MSCs),在此基礎(chǔ)上,用誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)MSCs向成纖維細(xì)胞分化,將獲得的具有成纖維細(xì)胞表型特征的細(xì)胞作為種子細(xì)胞,接種于膠原蛋白水凝膠構(gòu)建出TES,并進(jìn)行動(dòng)物模型皮膚缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)。這種方法既可以獲得來源充足的TES種子細(xì)胞,又可以避免ESCs應(yīng)用相關(guān)的倫理學(xué)限制,而且pESCs的低免疫原性還可以減輕免疫排斥反應(yīng)的程度,因此是一種最理想的構(gòu)建TES的方法,文獻(xiàn)中未見相關(guān)報(bào)道。 在本研究中,我們首先比較了pESCs和ESCs兩種胚胎干細(xì)胞的全能性和EBs中細(xì)胞的分化能力,對(duì)EBs的進(jìn)行貼壁培養(yǎng)期望獲得MSCs。進(jìn)一步通過分子生物學(xué)的方法檢測(cè)了所獲得的MSCs的性質(zhì),結(jié)果顯示pESCs具有和ESCs相同的特征和三胚層形成能力,所獲得的MSCs具有多系分化的能力。然后用所獲得的MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),獲得了具有成纖維細(xì)胞表型特征的細(xì)胞。最后將獲得的具有成纖維細(xì)胞表型特征的細(xì)胞接種于膠原水凝膠中構(gòu)建出具有一定形態(tài)和機(jī)械強(qiáng)度的TES,并在小鼠背部進(jìn)行缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn),通過大體標(biāo)本觀察和組織學(xué)觀察評(píng)價(jià)修復(fù)的效果,結(jié)果表明誘導(dǎo)獲得的成纖維細(xì)胞構(gòu)建的TES具有和小鼠成纖維細(xì)胞構(gòu)建的TES相似的皮膚缺損修復(fù)能力,并且pESCs來源的成纖維細(xì)胞構(gòu)建的TES的修復(fù)效果和小鼠成纖維細(xì)胞構(gòu)建的TES的修復(fù)效果沒有顯著差異(P0.05)。 (1) pESCs和ESCs兩種胚胎干細(xì)胞全能性基因Nanog、Oct3/4和未分化狀態(tài)標(biāo)志基因SSEA-1均在胞漿中高表達(dá),說明pESCs和ESCs保持了很好的未分化狀態(tài)�；チ鲂纬傻慕Y(jié)果顯示pESCs和ESCs都具有向三胚層分化的全能性。外胚層、中胚層和內(nèi)胚層的基因在EBs中依次表達(dá),隨后擴(kuò)增EBs貼壁培養(yǎng)25天后遷移出的細(xì)胞獲得MSCs。 (2)用分子生物學(xué)的方法檢測(cè)獲得的MSCs,流式細(xì)胞儀的結(jié)果顯示,所獲得的細(xì)胞表達(dá)MSCs的表面抗原；用MSCs分別向骨、軟骨和脂肪方向誘導(dǎo),組織化學(xué)結(jié)果顯示,誘導(dǎo)得到的細(xì)胞胞漿中分別具有典型的鈣結(jié)節(jié),軟骨基質(zhì)和大量脂滴,說明所獲得的MSCs具有向骨、軟骨和脂肪方向分化的能力。在接下來的實(shí)驗(yàn)中,我們?cè)贛SCs培養(yǎng)液中加入了誘導(dǎo)因子培養(yǎng)獲得了具有成纖維細(xì)胞典型特征的細(xì)胞,波形蛋白表達(dá)陽性,角蛋白表達(dá)陰性。 (3)我們將所獲得的具有成纖維細(xì)胞特征的細(xì)胞接種于膠原基質(zhì)中,成功構(gòu)建了TES,并與小鼠成纖維細(xì)胞所構(gòu)建的TES進(jìn)行修復(fù)效果的對(duì)比,大體形態(tài)觀察和組織學(xué)HE結(jié)果顯示具有基本相同的修復(fù)效果,比對(duì)照組修復(fù)愈合要提前約1-2天,并且比對(duì)照組修復(fù)效果要好。這說明pESCs能夠被定向誘導(dǎo)成為具有成纖維細(xì)胞典型特征的細(xì)胞,是一種理想的TES的種子細(xì)胞。
【關(guān)鍵詞】：pESCs ESCs 成纖維細(xì)胞 種子細(xì)胞 TES
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R318.0
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-18
• 1.1 ESCs的研究進(jìn)展11-13
• 1.1.1 ESCs和pESCs的研究發(fā)展11-12
• 1.1.2 目前存在的問題12-13
• 1.2 TES的研究和進(jìn)展13-15
• 1.2.1 TES的發(fā)展和分類13-14
• 1.2.2 種子細(xì)胞的來源14-15
• 1.2.3 目前存在的問題15
• 1.3 本實(shí)驗(yàn)研究的目的、意義及實(shí)驗(yàn)內(nèi)容15-18
• 1.3.1 實(shí)驗(yàn)的目的和意義15-16
• 1.3.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容16-18
• 第二章 pESCs和ESCs的擴(kuò)增培養(yǎng)和特征檢測(cè)18-24
• 2.1 實(shí)驗(yàn)試劑18
• 2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物18
• 2.3 實(shí)驗(yàn)儀器18
• 2.4 實(shí)驗(yàn)器材18-19
• 2.5 主要試劑配制19
• 2.5.1 PBS的配制19
• 2.5.2 4%多聚甲醛的配制19
• 2.5.3 0.1%Triton X-100的配制19
• 2.5.4 1%明膠的配制19
• 2.6 實(shí)驗(yàn)方法19-20
• 2.6.1 pESCs和ESCs的擴(kuò)增培養(yǎng)19
• 2.6.2 標(biāo)志基因的檢測(cè)19-20
• 2.6.3 畸胎瘤的HE染色20
• 2.7 實(shí)驗(yàn)結(jié)果20-22
• 2.7.1 pESCs和ESCs的形態(tài)學(xué)觀察21
• 2.7.2 標(biāo)志基因的檢測(cè)21
• 2.7.3 畸胎瘤的HE染色21-22
• 2.8 實(shí)驗(yàn)小結(jié)與討論22-24
• 第三章 pESCs和ESCs形成EBs及獲得MSCs24-32
• 3.1 實(shí)驗(yàn)試劑24
• 3.2 實(shí)驗(yàn)儀器24
• 3.3 實(shí)驗(yàn)器材24-25
• 3.4 主要試劑配制25
• 3.4.1 細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液25
• 3.4.2 PBS的配制25
• 3.5 實(shí)驗(yàn)方法25-27
• 3.5.1 EBs的形成和檢測(cè)25
• 3.5.2 EBs的貼壁培養(yǎng)和MSCs的獲得25-27
• 3.5.3 結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析27
• 3.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-30
• 3.6.1 EBs的免疫熒光染色結(jié)果27-28
• 3.6.2 EBs的貼壁培養(yǎng)和檢測(cè)28-30
• 3.7 實(shí)驗(yàn)小結(jié)與討論30-32
• 第四章 MSCs多系分化能力的檢測(cè)32-38
• 4.1 實(shí)驗(yàn)試劑32
• 4.2 實(shí)驗(yàn)儀器32
• 4.3 實(shí)驗(yàn)器材32
• 4.4 主要試劑配制32-33
• 4.4.1 細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液32-33
• 4.4.2 PBS的配制33
• 4.5 實(shí)驗(yàn)方法33-34
• 4.5.1 MSCs向成骨、軟骨和脂肪方向的誘導(dǎo)33
• 4.5.2 MSCs多系分化能力的檢測(cè)33-34
• 4.5.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原34
• 4.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-36
• 4.6.1 MSCs的觀察35
• 4.6.2 MSCs多系分化能力的檢測(cè)35
• 4.6.3 MSCs表面抗原的檢測(cè)35-36
• 4.7 實(shí)驗(yàn)小結(jié)與討論36-38
• 第五章 MSCs向成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)38-48
• 5.1 實(shí)驗(yàn)試劑38
• 5.2 實(shí)驗(yàn)儀器38
• 5.3 實(shí)驗(yàn)器材38
• 5.4 主要試劑配制38-39
• 5.4.1 細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液38-39
• 5.4.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)液的配制39
• 5.4.3 PBS的配制39
• 5.5 實(shí)驗(yàn)方法39-41
• 5.5.1 MSCs向成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)39
• 5.5.2 生長因子的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)39-40
• 5.5.3 生長因子的ELISA檢測(cè)40
• 5.5.4 波形蛋白和角蛋白的表達(dá)檢測(cè)40
• 5.5.5 細(xì)胞表面抗原的檢測(cè)40
• 5.5.6 結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析40-41
• 5.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-46
• 5.6.1 誘導(dǎo)所獲得細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察41
• 5.6.2 生長因子的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)41-43
• 5.6.3 生長因子的ELISA檢測(cè)43-45
• 5.6.4 免疫熒光檢測(cè)45-46
• 5.7 實(shí)驗(yàn)小結(jié)和討論46-48
• 第六章 TES的制備和移植實(shí)驗(yàn)48-57
• 6.1 實(shí)驗(yàn)試劑48
• 6.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物48
• 6.3 實(shí)驗(yàn)儀器48
• 6.4 實(shí)驗(yàn)器材48-49
• 6.5 主要試劑準(zhǔn)備和配制49
• 6.5.1 10×DMEM培養(yǎng)液的配制49
• 6.5.2 DMEM培養(yǎng)液的配制49
• 6.5.3 PBS的配制49
• 6.5.4 脫毛劑的配制49
• 6.5.5 麻醉劑的配制49
• 6.5.6 其他試劑的配制49
• 6.6 實(shí)驗(yàn)方法49-52
• 6.6.1 膠原蛋白的提取49-50
• 6.6.2 不含細(xì)胞TES的制備50
• 6.6.3 含細(xì)胞TES的制備50
• 6.6.4 含細(xì)胞TES的培養(yǎng)和觀察50-51
• 6.6.5 TES的移植51
• 6.6.6 取材及HE染色51
• 6.6.7 結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析51-52
• 6.7 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-55
• 6.7.1 TES的觀察52
• 6.7.2 移植實(shí)驗(yàn)52-55
• 6.8 實(shí)驗(yàn)小結(jié)和討論55-57
• 結(jié)論57-59
• 參考文獻(xiàn)59-66
• 附錄66-68
• 致謝68

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 PANG SuLei;WU QingQing;TIAN Sha;SU Pei;BAI Yang;GAO Jie;YANG YiQing;LIU Xin;ZHU ZhengMao;XU YuanFu;ZHOU JiaXi;;Establishment of a highly efficient hematopoietic differentiation model from human embryonic stem cells for functional screening[J];Science China(Life Sciences);2013年12期

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  本文關(guān)鍵詞：孤雌胚胎干細(xì)胞來源的組織工程皮膚種子細(xì)胞的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：331837