背景和目的:基因編輯是通過缺失,插入或替換DNA片段或特定堿基,來實(shí)現(xiàn)基因組可編程修飾的技術(shù),可以實(shí)現(xiàn)DNA的精確插入、刪除或造成遺傳物質(zhì)的改變。目前CRISPR/Cas9技術(shù)由于其高編輯效率和操作簡(jiǎn)單被廣泛用于基因組操作。單一引導(dǎo)RNA（sgRNA）與靶向序列結(jié)合后,Cas9蛋白在結(jié)合位點(diǎn)引入DNA雙鏈斷裂（DSB）。細(xì)胞通過非同源末端連接或同源重組途徑修復(fù)斷裂的雙鏈。HDR能產(chǎn)生精確修飾,而NHEJ在結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生插入和缺失（indels）,最終產(chǎn)生移碼突變,易位或其他DNA重排導(dǎo)致基因破壞。此外,DSB優(yōu)先通過NHEJ的途徑修復(fù),這最終導(dǎo)致基因組中的許多非靶向隨機(jī)變化。為了避免產(chǎn)生DSB,研究人員開發(fā)了基于CRISPR/Cas9的另一種基因編輯策略,稱為堿基編輯。胞嘧啶堿基編輯器（CBEs）由切口酶Cas9（nCas9）或催化缺陷型Cas9（dCas9）和胞嘧啶脫氨酶融合構(gòu)成,在sgRNA的引導(dǎo)下,能在靶位點(diǎn)處定點(diǎn)產(chǎn)生胞嘧啶（C）到胸腺嘧啶（T）,互補(bǔ)鏈上為鳥嘌呤（G）到腺嘌呤（A）的堿基轉(zhuǎn)換,同時(shí)不形成DSB。目前應(yīng)用最多的CBEs的胞嘧啶脫氨酶主要是大鼠APOBEC1（rAPO... 

【文章來源】：中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)重慶市

【文章頁(yè)數(shù)】：77 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

堿基編輯系統(tǒng)—MS2-BE的組成

圖 2-2 堿基編輯系統(tǒng)—MS2-BE 的編輯效率。A: 堿基編輯系統(tǒng) MS2-BE 在不同 sgRNA 的靶向作用下，在-32 到 28bp (以 PAM 為原點(diǎn)算起)編輯窗口內(nèi)的每個(gè)堿基位點(diǎn)編輯效率。B: 堿基編輯系統(tǒng) MS2-BE 在-32 到 28bp (以 PAM 為原點(diǎn)算起)編輯窗口內(nèi)的平均編輯效率。誤差線（±）表示三次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差。2.3.3 不同 Cas9 對(duì) MS2-BE 堿基編輯效率的影響為了優(yōu)化構(gòu)建的 MS2-BE 系統(tǒng)，我們嘗試更改其中的某一組成部分。首先，考慮到 Cas9 的變體，另一個(gè) Cas9 切口酶 nCas9（H840A) 能在 sgRNA 非互補(bǔ)鏈上產(chǎn)生切口。我們嘗試用 nCas9（H840A) 替換 nCas9(D10A)，或使用催化失活的 Cas9（dCas9）提高 MS2-BE 系統(tǒng)的編輯效率。我們通過藍(lán)白斑報(bào)告系統(tǒng)比較了使用不同Cas9 變體時(shí) MS2-BE 系統(tǒng)的突變效率。結(jié)果顯示，在三種 Cas9 變體中，dCas9 組有更高的白色菌落比例 (P <0.05)，說明在 MS2-BE 系統(tǒng)中用 dCas9 能獲得更高的突變效率。如圖 2-3 所示。

圖 2-3 不同 Cas9 對(duì) MS2-BE 堿基編輯效率的影響RNA-2X MS2，MCP-AID-UGI 和 dCas9 / nCas9（D10A）/ nCas9（pSP189 報(bào)道系統(tǒng)，并計(jì)算白色菌落的百分比。數(shù)據(jù)采用兩因素方獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差。 * P <0.05; ** P <0.01。脫氨酶對(duì) MS2-BE 堿基編輯效率的影響 的第二個(gè)重要組成部分是脫氨酶。除了胞嘧啶脫氨酶 AGI 融合到 MCP 的 C 末端來構(gòu)建 MCP-rAPOBEC1。然后我統(tǒng)比較了使用不同脫氨酶時(shí) MS2-BE 系統(tǒng)的編輯效率。中：當(dāng)使用 dCas9 時(shí)，MCP-rAPOBEC1 組的白色菌落比率高)；使用 nCas9 (D10A)獲得了相同的結(jié)果 (P <0.01)；但使用 OBEC1 和 MCP-AID 組的白色菌落比例沒有顯著差異。這些 nCas9 (D10A)時(shí)，在 MS2-BE系統(tǒng)中脫氨酶 rAPOBEC1比

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]A CRISPR/Cas9 toolkit for efficient targeted base editing to induce genetic variations in rice[J]. Bin Ren,Fang Yan,Yongjie Kuang,Na Li,Dawei Zhang,Honghui Lin,Huanbin Zhou.  Science China（Life Sciences）. 2017(05)



本文編號(hào)：3288683