背景:課題組在前期研究的基礎(chǔ)上,體外分離、培養(yǎng)及鑒定新西蘭大白兔距骨軟骨細(xì)胞。目的:探討新西蘭大白兔距骨軟骨細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)及鑒定的實(shí)驗(yàn)方法。方法:課題組采用單純Ⅱ型膠原酶消化法體外分離新西蘭大白兔距骨軟骨細(xì)胞,進(jìn)行體外培養(yǎng),通過形態(tài)學(xué)觀察、甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠原蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果與結(jié)論:（1）倒置相差顯微鏡觀察3代以內(nèi)新西蘭大白兔距骨軟骨細(xì)胞呈多角形或三角形,核為圓形或橢圓形;（2）甲苯胺藍(lán)染色可見新西蘭大白兔距骨軟骨細(xì)胞呈紫藍(lán)色,細(xì)胞基質(zhì)呈藍(lán)色;（3）Ⅱ型膠原蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見新西蘭大白兔距骨軟骨細(xì)胞胞漿及胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒;（4）實(shí)驗(yàn)成功建立了新西蘭大白兔距骨軟骨細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)及鑒定體系;實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示3代以內(nèi)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)良好,保持軟骨細(xì)胞穩(wěn)定的生物學(xué)特征。 

【文章來源】：中國(guó)組織工程研究. 2017,21(28)北大核心

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【部分圖文】：

兔原代距骨軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征(×100)

風(fēng)干爬片，中性樹膠封固，倒置相差顯微鏡觀察距骨軟骨細(xì)胞染色情況[21，27]。Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的新西蘭大白兔距骨軟骨細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片，每張細(xì)胞爬片加50μL過氧化物酶阻斷溶液，室溫下孵育10min，PBS沖洗3次(3min/次)，去除PBS，加50μL正常非免疫動(dòng)物血清，室溫下孵育10min，去除血清，加50μL的一抗，室溫下孵圖1兔原代距骨軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征(×100)Figure1Morphologyoftheprimaryrabbittalarchondrocyts(x100)圖注：圖A為軟骨細(xì)胞接種3d后；B為軟骨細(xì)胞種7d后，呈“鋪路石”樣。圖2兔傳代距骨軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征(×100)Figure2Morphologyoftheculturedrabbittalarchondrocyts(x100)圖注：圖A為第1代距骨軟骨細(xì)胞接種3d后，單層生長(zhǎng)，彼此不相接觸；圖B為第1代距骨軟骨細(xì)胞種7d后，互相連接成“鋪路石”樣。圖3兔原代距骨軟骨細(xì)胞吖啶橙熒光染色結(jié)果(×200)Figure3Acridineorangefluorescentstainingoftheprimaryrabbittalarchondrocyts(x200)圖注：圖A為軟骨細(xì)胞接種3d；B為軟骨細(xì)胞種7d�？梢娋喙擒浌羌�(xì)胞核呈清晰綠色熒光。圖4兔傳代距骨軟骨細(xì)胞吖啶橙熒光染色結(jié)果(×200)Figure4Acridineorangefluorescentstainingoftheculturedrabbittalarchondrocyts(x200)圖注：圖A第1代距骨軟骨細(xì)胞接種3d后；B為第1代距骨軟骨細(xì)胞種7d后。增殖速度也較原代細(xì)胞快。圖5兔第1代距骨軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果(×200)Figure5ToluidinebluestainingandcollagentypeIIimmunohistochemicalstainingofthepassage1rabbittalarchondrocyts(×200)圖注：圖A為甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果證明軟骨細(xì)胞合成和分泌蛋白聚糖；B為Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果證明細(xì)胞表達(dá)軟骨細(xì)胞特征性Ⅱ型膠

PBS沖洗3次(3min/次)，去除PBS，加50μL正常非免疫動(dòng)物血清，室溫下孵育10min，去除血清，加50μL的一抗，室溫下孵圖1兔原代距骨軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征(×100)Figure1Morphologyoftheprimaryrabbittalarchondrocyts(x100)圖注：圖A為軟骨細(xì)胞接種3d后；B為軟骨細(xì)胞種7d后，呈“鋪路石”樣。圖2兔傳代距骨軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征(×100)Figure2Morphologyoftheculturedrabbittalarchondrocyts(x100)圖注：圖A為第1代距骨軟骨細(xì)胞接種3d后，單層生長(zhǎng)，彼此不相接觸；圖B為第1代距骨軟骨細(xì)胞種7d后，互相連接成“鋪路石”樣。圖3兔原代距骨軟骨細(xì)胞吖啶橙熒光染色結(jié)果(×200)Figure3Acridineorangefluorescentstainingoftheprimaryrabbittalarchondrocyts(x200)圖注：圖A為軟骨細(xì)胞接種3d；B為軟骨細(xì)胞種7d�？梢娋喙擒浌羌�(xì)胞核呈清晰綠色熒光。圖4兔傳代距骨軟骨細(xì)胞吖啶橙熒光染色結(jié)果(×200)Figure4Acridineorangefluorescentstainingoftheculturedrabbittalarchondrocyts(x200)圖注：圖A第1代距骨軟骨細(xì)胞接種3d后；B為第1代距骨軟骨細(xì)胞種7d后。增殖速度也較原代細(xì)胞快。圖5兔第1代距骨軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果(×200)Figure5ToluidinebluestainingandcollagentypeIIimmunohistochemicalstainingofthepassage1rabbittalarchondrocyts(×200)圖注：圖A為甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果證明軟骨細(xì)胞合成和分泌蛋白聚糖；B為Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果證明細(xì)胞表達(dá)軟骨細(xì)胞特征性Ⅱ型膠原。0.300.280.260.240.220.200.18光度值吸1234567891011121314圖6兔第1代距骨軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Figure6Growthcurveofthepassage1rabbittalarchondrocyts圖注：第1代軟骨細(xì)胞0-3d增殖緩慢，4-6d快速增殖并達(dá)到高?

【參考文獻(xiàn)】：
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