背景:課題組在前期研究的基礎上,體外分離、培養(yǎng)及鑒定新西蘭大白兔距骨軟骨細胞。目的:探討新西蘭大白兔距骨軟骨細胞體外分離、培養(yǎng)及鑒定的實驗方法。方法:課題組采用單純Ⅱ型膠原酶消化法體外分離新西蘭大白兔距骨軟骨細胞,進行體外培養(yǎng),通過形態(tài)學觀察、甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原蛋白免疫細胞化學染色對軟骨細胞進行鑒定。結果與結論:（1）倒置相差顯微鏡觀察3代以內新西蘭大白兔距骨軟骨細胞呈多角形或三角形,核為圓形或橢圓形;（2）甲苯胺藍染色可見新西蘭大白兔距骨軟骨細胞呈紫藍色,細胞基質呈藍色;（3）Ⅱ型膠原蛋白免疫細胞化學染色可見新西蘭大白兔距骨軟骨細胞胞漿及胞膜出現棕黃色顆粒;（4）實驗成功建立了新西蘭大白兔距骨軟骨細胞體外分離、培養(yǎng)及鑒定體系;實驗結果提示3代以內軟骨細胞生長良好,保持軟骨細胞穩(wěn)定的生物學特征。 

【文章來源】：中國組織工程研究. 2017,21(28)北大核心

【文章頁數】：6 頁

【部分圖文】：

兔原代距骨軟骨細胞形態(tài)學特征(×100)

風干爬片，中性樹膠封固，倒置相差顯微鏡觀察距骨軟骨細胞染色情況[21，27]。Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色：取生長狀態(tài)良好的新西蘭大白兔距骨軟骨細胞進行細胞爬片，每張細胞爬片加50μL過氧化物酶阻斷溶液，室溫下孵育10min，PBS沖洗3次(3min/次)，去除PBS，加50μL正常非免疫動物血清，室溫下孵育10min，去除血清，加50μL的一抗，室溫下孵圖1兔原代距骨軟骨細胞形態(tài)學特征(×100)Figure1Morphologyoftheprimaryrabbittalarchondrocyts(x100)圖注：圖A為軟骨細胞接種3d后；B為軟骨細胞種7d后，呈“鋪路石”樣。圖2兔傳代距骨軟骨細胞形態(tài)學特征(×100)Figure2Morphologyoftheculturedrabbittalarchondrocyts(x100)圖注：圖A為第1代距骨軟骨細胞接種3d后，單層生長，彼此不相接觸；圖B為第1代距骨軟骨細胞種7d后，互相連接成“鋪路石”樣。圖3兔原代距骨軟骨細胞吖啶橙熒光染色結果(×200)Figure3Acridineorangefluorescentstainingoftheprimaryrabbittalarchondrocyts(x200)圖注：圖A為軟骨細胞接種3d；B為軟骨細胞種7d。可見距骨軟骨細胞核呈清晰綠色熒光。圖4兔傳代距骨軟骨細胞吖啶橙熒光染色結果(×200)Figure4Acridineorangefluorescentstainingoftheculturedrabbittalarchondrocyts(x200)圖注：圖A第1代距骨軟骨細胞接種3d后；B為第1代距骨軟骨細胞種7d后。增殖速度也較原代細胞快。圖5兔第1代距骨軟骨細胞甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色結果(×200)Figure5ToluidinebluestainingandcollagentypeIIimmunohistochemicalstainingofthepassage1rabbittalarchondrocyts(×200)圖注：圖A為甲苯胺藍染色結果證明軟骨細胞合成和分泌蛋白聚糖；B為Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色結果證明細胞表達軟骨細胞特征性Ⅱ型膠

PBS沖洗3次(3min/次)，去除PBS，加50μL正常非免疫動物血清，室溫下孵育10min，去除血清，加50μL的一抗，室溫下孵圖1兔原代距骨軟骨細胞形態(tài)學特征(×100)Figure1Morphologyoftheprimaryrabbittalarchondrocyts(x100)圖注：圖A為軟骨細胞接種3d后；B為軟骨細胞種7d后，呈“鋪路石”樣。圖2兔傳代距骨軟骨細胞形態(tài)學特征(×100)Figure2Morphologyoftheculturedrabbittalarchondrocyts(x100)圖注：圖A為第1代距骨軟骨細胞接種3d后，單層生長，彼此不相接觸；圖B為第1代距骨軟骨細胞種7d后，互相連接成“鋪路石”樣。圖3兔原代距骨軟骨細胞吖啶橙熒光染色結果(×200)Figure3Acridineorangefluorescentstainingoftheprimaryrabbittalarchondrocyts(x200)圖注：圖A為軟骨細胞接種3d；B為軟骨細胞種7d�？梢娋喙擒浌羌毎顺是逦G色熒光。圖4兔傳代距骨軟骨細胞吖啶橙熒光染色結果(×200)Figure4Acridineorangefluorescentstainingoftheculturedrabbittalarchondrocyts(x200)圖注：圖A第1代距骨軟骨細胞接種3d后；B為第1代距骨軟骨細胞種7d后。增殖速度也較原代細胞快。圖5兔第1代距骨軟骨細胞甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色結果(×200)Figure5ToluidinebluestainingandcollagentypeIIimmunohistochemicalstainingofthepassage1rabbittalarchondrocyts(×200)圖注：圖A為甲苯胺藍染色結果證明軟骨細胞合成和分泌蛋白聚糖；B為Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色結果證明細胞表達軟骨細胞特征性Ⅱ型膠原。0.300.280.260.240.220.200.18光度值吸1234567891011121314圖6兔第1代距骨軟骨細胞生長曲線Figure6Growthcurveofthepassage1rabbittalarchondrocyts圖注：第1代軟骨細胞0-3d增殖緩慢，4-6d快速增殖并達到高?

【參考文獻】：
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