目的通過為人體吸脂來源的脂肪組織脫細(xì)胞,評估脫細(xì)胞脂肪組織的組織學(xué)成分,探討其作為組織工程支架材料的可能性。方法采用改良的脫細(xì)胞方法為5例人吸脂來源的脂肪組織脫細(xì)胞,觀察制備過程的大體形態(tài),對脫細(xì)胞脂肪進(jìn)行HE染色、Masson染色、Gomori染色、油紅O染色、DAPI染色,并對脫細(xì)胞組織中殘留的DNA、膠原蛋白及糖胺聚糖含量進(jìn)行定量檢測。結(jié)果本實驗制備的脫細(xì)胞脂肪,外觀呈不透明的乳白色,無固定形態(tài)。HE染色和DAPI染色無可見細(xì)胞成分殘留,Masson染色可見膠原纖維,Gomori染色可見網(wǎng)狀纖維存在,油紅O染色無可見脂質(zhì)殘留。組織中殘留的DNA含量微小,膠原和糖胺聚糖含量均有所保留。結(jié)論應(yīng)用結(jié)合物理化學(xué)和酶學(xué)的脫細(xì)胞方法,可以為人體的吸脂來源脂肪組織脫細(xì)胞,得到的脫細(xì)胞組織去除了脂肪組織中的細(xì)胞及脂質(zhì)成分,保留了脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)的組成成分。 

【文章來源】：解剖學(xué)報. 2020,51(01)北大核心

【文章頁數(shù)】：4 頁

【部分圖文】：

脂肪和DAT中膠原及GAG含量檢測與脂肪組對比，*P<0.05;**P<0.01

圖1 人脂肪組織脫細(xì)胞過程的大體形態(tài)通過對比正常脂肪組織和DAT的組織學(xué)染色，可以觀察到在HE染色中，脂肪組織細(xì)胞排列成蜂巢狀，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，呈空泡形，細(xì)胞核位于一側(cè)(圖2A)。而DAT則喪失了脂肪組織的正常結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)為一種無序的纖維排列，這些結(jié)構(gòu)是由絲狀的纖維成分彼此交織而成，視野中看不到任何細(xì)胞存在的痕跡(圖2B)。Masson染色中可以看到大量膠原纖維的存在，這些膠原纖維是構(gòu)成DAT的主要成分，它們彼此交織成有空隙的條索(圖2D)。Gomori染色結(jié)果顯示，脫細(xì)胞后網(wǎng)狀纖維的成分被保留下來(圖2F)。DAPI染色后，熒光顯微鏡下觀察，在DAT中未見代表細(xì)胞核的藍(lán)色熒光點(圖2H)，而在脂肪組織中，能明顯看到大量藍(lán)色熒光點的存在(圖2G)。油紅O染色提示，在DAT中無明顯脂質(zhì)成分殘留(圖2J)。采用Quant-PicoGreen DNA檢測試劑盒對DAT中殘余DNA含量進(jìn)行定量檢測，結(jié)果為(9.26±2.85)mg/kg干重，符合Gilbert提出的關(guān)于脫細(xì)胞組織中DNA含量<50 mg/kg干重的評價標(biāo)準(zhǔn)。各種脫細(xì)胞方法都不能完全去除全部細(xì)胞成分，在已獲得臨床應(yīng)用的ECM材料中仍能檢測到微量DNA片段的存在，鑒于其在臨床上的成功應(yīng)用，說明殘余的DAN片段不會引起機體的排斥反應(yīng)。而本研究提取的DAT是否具有良好的細(xì)胞和組織相容性，仍需在進(jìn)一步實驗中驗證。檢測5組供體的新鮮脂肪及DAT中的膠原蛋白含量(圖3)，結(jié)果為DAT中膠原蛋白含量為(371.57±62.02)g/kg干重，脂肪組織中的膠原蛋白含量為(416.68±63.88)g/kg干重。檢測5組供體的DAT和新鮮脂肪的GAG的含量，結(jié)果分為(4.88±0.77)g/kg干重和(8.00±1.05)g/kg干重。表明經(jīng)過一系列脫細(xì)胞處理后，DAT中保留了相當(dāng)數(shù)量的膠原蛋白和GAG，但較脫細(xì)胞前有不同程度的減少，表明我們所采用的脫細(xì)胞方法在有效去除細(xì)胞和脂質(zhì)的同時，對細(xì)胞外基質(zhì)的成分有一定的損耗，但膠原蛋白和GAG含量的減少是否會對DAT的生物學(xué)活性產(chǎn)生比較大的影響，仍需在進(jìn)一步的實驗中進(jìn)行檢測。提取的脂肪細(xì)胞外基質(zhì)能否作為三維打印支架的來源也需要在進(jìn)一步的實驗中進(jìn)行檢測[5]。

實驗中可以觀察到，將吸脂后得到的脂肪組織(圖1A)，經(jīng)高低滲透壓液體反復(fù)浸泡振蕩及多次凍融循環(huán)后，可見脂肪顏色變淺，類糜狀，表面有大量脂滴漂浮(圖1B)。組織經(jīng)勻漿離心后可分為3 層，上層為細(xì)胞破壞后分離出來的游離脂質(zhì)，中層為殘余的脂肪，底層的白色絮狀物為所要提取的物質(zhì)(圖1C)。將全部的白色沉淀收集起來，分別加入到triton X-100、異丙醇和含有DNA酶和RNA酶的高滲氯化鈉中振蕩，再次離心后，最終得到一種類似膠原的乳白色的軟體物質(zhì)，具有一定的體積及韌性(圖1D)。提取組織體積約占脫細(xì)胞前脂肪體積的1/10，提示在脂肪組織中，細(xì)胞和油脂成分占更大的比重，因而在去除了細(xì)胞和脂質(zhì)成分后，DAT體積有了明顯縮小。圖2 脂肪和DAT的組織學(xué)染色


本文編號：3072157