目的:驗證慢病毒介導hBMP-2和hVEGF-165雙基因轉染(兩次轉染)BMSCs的可行性和轉染后BMSCs更良好的誘導成骨性能。方法:分離提取兔BMSCs,流式細胞儀鑒定;將攜帶hBMP-2基因的慢病毒轉染第三代兔BMSCs,細胞倍增后,一半作為單基因轉染組,一半用攜帶hVEGF-165基因的慢病毒再次轉染,熒光顯微鏡下觀察。至此,BMSCs分為4組,A組為未轉染組、B組為兩次轉染熒光蛋白基因的空載組、C組為BMP2單基因轉染組、D組為hBMP-2和hVEGF-165雙基因轉染組;轉染后不同時間點Western Blot檢測目的蛋白表達及變化,MTT檢測各組細胞增殖活性,轉染后14d檢測各組堿性磷酸酶活性。轉染后經(jīng)成骨誘導培養(yǎng)6周,茜素紅染色檢測骨結節(jié)。結果:1.B、C、D組轉后染熒光顯微鏡下均可見相應的綠色及紅色熒光蛋白表達。轉染后3d C、D組均有相應目的蛋白高表達,轉染后7d、14d、21d,目的蛋白檢測無明顯變化(p0.05);2.細胞增殖檢測可見D組增殖稍快于C組(p0.05),C組又明顯快于A、B組(p0.05),A、B組細胞增殖曲線的走行方向基本一致(p0.05);3.A、B組堿性磷酸酶染色僅約5%細胞被深染,C組為80%、D組為90%。C、D組ALP活力明顯高于A、B組,D組高于C組約1/5。4.C組茜素紅染色出的骨結節(jié)數(shù)量明顯多于A、B組,D組骨結節(jié)數(shù)量比C組稍多且大。結論:慢病毒介導的hBMP-2和hVEGF-165雙基因經(jīng)兩次轉染能成功轉入兔BMSCs內,并長期穩(wěn)定表達,該雙因子的表達能刺激細胞堿性磷酸酶生成,促進間充質干細胞更好的向成骨細胞分化。
【學位單位】：桂林醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R68;R318.08
【部分圖文】：

圖 1 原代 BMSCs 傳代后細胞分布均勻，排列呈漩渦狀、魚群狀，細胞呈短梭形、三角形。Figure 1 The cell morphology of the 3 th generation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (×100)

圖 2 首次轉染第 7 天，即第二次轉染后第 4 天，實驗組和空載組細胞在熒光顯微鏡下均見到綠色和紅色熒光表達，熒光下細胞形態(tài)未見明顯改變，綜合轉染率可達 95%以上。

圖 3 雙基因轉染組轉染后 3 日 western blot 檢測目的蛋白。Figure 3 Double-gene transfection group was detected by western b
【參考文獻】

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1 石正松;李強;蔡偉良;寧寅寬;李詩鵬;;腺病毒介導hBMP-2轉染BMSCs復合DBM修復兔缺血性股骨頭壞死的實驗研究[J];天津醫(yī)藥;2015年10期

2 寧寅寬;李強;蔡偉良;武成聰;陳佳濱;石正松;;Ad-BMP-2/GFP轉染兔骨髓間充質干細胞前后生物學特性的研究[J];中國骨質疏松雜志;2014年12期

3 李耀華;;大塊血管化組織工程骨修復的骨缺損[J];中國組織工程研究;2014年07期

本文編號：2876068