目的:制備SF-CS-nHAp漸進(jìn)性梯度孔徑OC支架并完成其性能檢測,以期為OC缺損的修復(fù)提供一種更加合適的仿生復(fù)合支架。方法:分別制備濃度分別為2%、3%、4%的SF溶液、CS溶液及nHA懸液,將相同濃度的材料等比例混合,分為支架-1(2%)、支架-2(3%)、支架-3(4%)三組。采用離心、真空冷凍干燥及化學(xué)交聯(lián)法,經(jīng)過三次塑形,制備出濃度不同的漸進(jìn)性梯度孔徑OC支架。分別檢測各組支架一般情況、孔隙率、吸水膨脹率、壓縮吸水膨脹率、熱水溶失率、溶失后吸水膨脹率、力學(xué)性能、支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察及孔徑大小,并分析得出整體性能較好的支架。采用膠原酶消化法提取山羊ADSCs,通過免疫熒光法及流式細(xì)胞術(shù)對其進(jìn)行鑒定,并通過CCK-8法檢測ADSCs增殖活性。制備支架浸提液,通過CCK-8法檢測不同時間段支架浸提液對ADSCs增殖活性的影響。將ADSCs種植在支架中構(gòu)建成支架-ADSCs復(fù)合體,并通過CCK-8法檢測支架-ADSCs復(fù)合體中各層細(xì)胞增殖情況,通過細(xì)胞核熒光染色法及SEM觀察支架-ADSCs復(fù)合體中各層細(xì)胞分布及形態(tài)。結(jié)果:各組支架均呈白色,形狀規(guī)則,近似為圓柱體,質(zhì)量極輕,觸之有一定的抗壓能力及彈性。支架-1、支架-2、支架-3孔隙率分別為(91.30±3.35)%、(89.50±3.11)%、(82.58±1.47)%,支架-3孔隙率則低于另外兩組(P0.05);吸水膨脹率分別為(3218.53±84.37)%、(2573.83±132.51)%、(1969.50±90.01)%,并且隨材料濃度增高而逐漸減小(P0.05);壓縮吸水膨脹率分別為(1587.27±63.09)%、(2379.53±77.04)%、(1989.53±118.90)%,與壓縮前吸水膨脹率相比,支架-1明顯降低(P0.05),支架-2及支架-3無明顯變化(P0.05);熱水溶失率分別為(16.57±3.18)%、(15.03±2.17)%、(15.65±0.68)%,各組間相比無明顯差異(P0.05),回歸分析顯示支架在體外完全溶失,分別需要65.85、60.92、73.86周;溶失后吸水膨脹率分別為(4267.15±132.31)%、(3192.30±223.41)%、(2807.70±235.16)%,與溶失前吸水膨脹率相比,三組支架溶失后吸水膨脹率均明顯升高(P0.05);彈性模量分別為(0.0955、0.1762、0.3468)MPa;SEM顯示各組支架內(nèi)部均呈現(xiàn)為蜂窩狀,孔隙形狀規(guī)則、互通,從支架成軟骨側(cè)到成骨側(cè)孔隙分布逐漸密集、孔隙直徑逐漸減小(P0.05)。通過膠原酶消化法提取的ADSCs形態(tài)均一,形狀似紡錘形,呈漩渦樣生長,細(xì)胞增殖活性良好。流式細(xì)胞術(shù)鑒定ADSCs細(xì)胞表型結(jié)果顯示CD29、CD90、CD44陽性表達(dá)率均為90%以上,而CD34、HLA-DR、IgG-Isotype control、Blank陽性表達(dá)率均小于5%,免疫熒光結(jié)果與流式鑒定結(jié)果一致。支架細(xì)胞毒性檢測結(jié)果顯示,不同時間段的支架浸提液對ADSCs的增殖活性均無明顯影響,RGR值均大于90%,毒性評級均在0至Ⅰ級之間。支架-ADSCs復(fù)合體各層細(xì)胞在培養(yǎng)第3d后開始出現(xiàn)對數(shù)期增殖,第11d后進(jìn)入平臺期,在培養(yǎng)的第5-15d,復(fù)合體成軟骨側(cè)的細(xì)胞增殖活性稍高于成骨側(cè)(P0.05)。DAPI染色后可觀察到支架各層內(nèi)細(xì)胞分布均勻,細(xì)胞核形態(tài)大小均一,細(xì)胞核無明顯異染及碎裂現(xiàn)象;SEM觀察到支架-ADSCs復(fù)合體各層孔隙內(nèi)壁上可見大量細(xì)胞粘附,細(xì)胞形態(tài)大小均一,呈長梭形緊密排列,未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞破碎或形態(tài)異常。結(jié)論:本研究成功制備出漸進(jìn)性梯度孔徑OC支架,支架各項物理性能良好,符合正常OC由軟骨層向骨層的漸進(jìn)性梯度結(jié)構(gòu)。本研究成功提取純度較高的ADSCs,并且成功構(gòu)建支架-ADSCs復(fù)合體,經(jīng)檢測支架無細(xì)胞毒性并且生物相容性良好。綜上,本研究所制備的SF-CS-nHAp漸進(jìn)性梯度孔徑OC支架及支架-ADSCs復(fù)合體,有望成為修復(fù)OC缺損的新型仿生復(fù)合支架材料。
【學(xué)位單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R318.08
【部分圖文】：

圖 1 SF-CS-nHAp 漸進(jìn)性梯度孔徑 OC 支架的制備方法及物理性能檢測示意圖（1）SF 溶液制備 將 SF 置于三元溶液[摩爾比 CaCl2：H2O：C2H5OH=1：8：2]中，在 80℃、300rpm 條件下，磁力攪拌 1h 左右溶解。溶解后將溶液轉(zhuǎn)移至截留分子量

圖 2 山羊 ADSCs 提取、培養(yǎng)、鑒定及活性檢測示意圖（1）ADSCs 提取及培養(yǎng) 取山羊 1 只，采用 10%水合氯醛（300mg/kg）對其進(jìn)行腔內(nèi)注射麻醉，無菌取腹股溝區(qū)脂肪組織約 4g。將脂肪組織迅速轉(zhuǎn)移至超凈臺，

圖 3 SF-CS-nHAp 漸進(jìn)性梯度孔徑 OC 支架的生物相容性檢測示意圖（1）支架體外細(xì)胞毒性實驗 根據(jù)物理性能檢測結(jié)果分析并選擇更為合適的支架進(jìn)行體外細(xì)胞毒性試驗。將成功制備的支架通過環(huán)氧乙烷滅菌，再用含 1%雙抗的無菌1×PBS 溶液在 37℃條件下恒溫震蕩處理（即 PBS 緩沖液平衡支架酸堿度）3d。將處
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