第一部分脂肪組織提取物對干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞生長分化以及大鼠創(chuàng)口愈合的影響背景與目的:組織工程和再生醫(yī)學(xué)是修復(fù)組織器官缺損、實現(xiàn)其解剖學(xué)和功能學(xué)再生的重要途徑之一。而實現(xiàn)大面積、長距離的組織修復(fù)和替代,移植物內(nèi)干細(xì)胞的生存和活性以及新生組織的血管化尤為重要。脂肪組織不僅是儲能器官,還是龐大的內(nèi)分泌器官,其中富含脂肪源性細(xì)胞因子,具有一定的生物活性和生理功能。本部分研究擬采用方便易行的方法提取脂肪組織提取物(ATE),研究其對間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞生長分化以及對創(chuàng)口愈合的影響,并探討其在組織修復(fù)中的應(yīng)用價值。方法:取成年SD大鼠腹股溝處皮下脂肪提取ATE,并提取大鼠脂肪源干細(xì)胞(ADSCs)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)和血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)。以ATE培養(yǎng)兩類干細(xì)胞,CCK-8法檢測其對干細(xì)胞增殖的影響,并檢測細(xì)胞內(nèi)干性蛋白標(biāo)志物Sox-2、Oct-4和Nonag的表達(dá)以評價ATE對其多向分化潛能的影響。以ATE培養(yǎng)ECs,通過CCK-8、劃痕實驗、Transwell遷移實驗、Matrigel體外成管實驗評價其對內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移以及成管化的影響。進一步地,我們將其與透明質(zhì)酸(HA)混合共溶制備含有ATE的凍干海綿(ATE/HA),并作為敷料覆蓋于大鼠背部皮膚創(chuàng)口上,以觀察其在組織修復(fù)中的作用并行組織切片分析其修復(fù)過程中炎性指標(biāo)CD45和血管化指標(biāo)CD31。另外,我們使用細(xì)胞因子芯片對ATE這一脂肪源性細(xì)胞因子復(fù)合體進行了成分分析,以探索和討論其產(chǎn)生相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)可能的機制。結(jié)果:通過ATE對干細(xì)胞的培養(yǎng),ADSCs和BMSCs的增殖較高于不添加ATE的對照組,且其干性蛋白標(biāo)志物表達(dá)也一定程度地增多。通過ATE對ECs的培養(yǎng),ECs的增殖亦有所增強。劃痕實驗中ATE培養(yǎng)的實驗組細(xì)胞遷移距離大于對照組(85.92±15.52mm vs 35.33±24.85mm,p0.05),Transwell遷移實驗中實驗組遷移細(xì)胞的數(shù)量多于對照組(19.8±4.8/hpf vs 1.2±0.8/hpf,p0.05),Matrigel體外成管化實驗中實驗組小管平均周長和面積均大于對照組(426.61±91.47mm vs 266.06±72.90mm,p0.05;13314.29±6784.42mm~2 vs 5082.76±2433.00mm~2,p0.05)。動物實驗中,覆蓋含ATE敷料的創(chuàng)口修復(fù)速度快于對照組,且第10天時免疫組化顯示,ATE組中CD31和CD45的表達(dá)均較高。細(xì)胞因子芯片對ATE進行成分檢測,結(jié)果顯示ATE中含有脂聯(lián)素、血管內(nèi)皮生長因子、白介素、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、巨噬細(xì)胞源性趨化因子等諸多細(xì)胞因子。結(jié)論:ATE中含有諸多脂肪源性細(xì)胞因子,具有一定的生物活性。它可一定程度上促進干細(xì)胞增殖,維持干細(xì)胞的多向分化潛能。同時,ATE對ECs的增殖、遷移和成管化具有一定的促進作用。另外,ATE可促進創(chuàng)傷修復(fù)和愈合,這可能與其促進血管新生有關(guān)。因此,ATE有一定潛能作為一種生物添加劑,應(yīng)用于組織工程修復(fù)和再生。第二部分脂肪組織提取物負(fù)載至靜電紡絲納米纖維制備“三明治”結(jié)構(gòu)補片修復(fù)膀胱壁的研究背景與目的:各種先天或后天因素可能導(dǎo)致膀胱的損傷或缺失,膀胱組織工程被認(rèn)為是未來修復(fù)大面積膀胱缺損乃至替換膀胱的途徑之一。然而膀胱具有一定的儲尿和排尿功能,如何實現(xiàn)新生膀胱的功能化是目前膀胱組織工程領(lǐng)域亟待解決的問題。新生膀胱組織中內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和血管化、尿路上皮細(xì)胞和膀胱平滑肌細(xì)胞的遷入和生長,被認(rèn)為是實現(xiàn)膀胱功能性修復(fù)的關(guān)鍵因素。靜電紡絲是組織工程中常用的制備納米纖維膜的方法之一。載藥納米纖維不僅可以實現(xiàn)結(jié)構(gòu)上的修復(fù),又能根據(jù)不同的需要而負(fù)載相關(guān)藥物、蛋白、細(xì)胞因子、納米顆粒等等,使之具備一定的生物活性,從而滿足功能性修復(fù)的需求。脂肪組織提取物(ATE)中富含脂肪源性細(xì)胞因子,具有一定的促細(xì)胞增殖、遷移以及促血管生成能力。因此,在本部分實驗中,我們嘗試將ATE負(fù)載至聚乳酸-聚己內(nèi)酯(PLCL)電紡納米纖維膜上構(gòu)建具有一定生物活性的“三明治”結(jié)構(gòu)仿生補片,以期實現(xiàn)膀胱的解剖學(xué)和功能學(xué)修復(fù)。方法:靜電紡絲法制備PLCL納米纖維膜,ATE與透明質(zhì)酸(HA)混合制備ATE/HA溶液,涂布包被于PLCL纖維膜并凍干制備得“三明治”結(jié)構(gòu)納米纖維補片(ATE/HA-PLCL),進行掃描電鏡觀察,并行力學(xué)性能測試和接觸角檢測以評價其材料學(xué)特征。行大鼠皮下移植評測其組織相容性。進一步地,我們制作了大鼠膀胱缺損模型,并以ATE/HA-PLCL補片進行修復(fù),以PLCL補片作為對照,術(shù)后8周進行Micro-CT掃描、尿動力學(xué)檢測,評價修復(fù)后膀胱的功能。另外,我們在術(shù)后8周進行組織切片檢測,以HE染色、Masson染色以及CD31免疫組化染色觀察其尿路上皮和平滑肌生長情況以及新血管生成情況。結(jié)果:制得的ATE/HA-PLCL納米纖維補片纖維直徑763±31nm,孔隙率為82.7±2.4%,ATE/HA層呈多孔海綿結(jié)構(gòu),且兩層之間相互融合連接緊密。力學(xué)性能檢測其楊氏模量為15.35±1.47MPa,親水性檢測其接觸角為87.7±1.8°。大鼠皮下移植4周后見材料部分生物降解,未見明顯CD45、CD68陽性炎細(xì)胞浸潤。膀胱修復(fù)實驗中,術(shù)后8周后,經(jīng)Micro-CT掃描ATE/HA-PLCL組膀胱內(nèi)未見明顯膀胱結(jié)石生成,而對照的PLCL組可見少量結(jié)石影附著于膀胱壁。尿動力學(xué)檢測結(jié)果顯示ATE/HA-PLCL組膀胱容量具有大于PLCL組膀胱容量的趨勢(1.53±0.36m L vs 1.16±0.30m L,p=0.07),而明顯大于Blank組膀胱容量(1.53±0.36m L vs 0.84±0.30m L,p0.05)。在膀胱順應(yīng)性上,ATE/HA-PLCL組優(yōu)于PLCL組(0.30±0.10m L/cm H2O vs0.18±0.13 m L/cm H2O,p0.05)。HE染色見ATE/HA-PLCL組尿路上皮呈復(fù)層結(jié)構(gòu)且連續(xù),Masson染色見肌性纖維組織增多,免疫組化提示ATE/HA-PLCL組新生膀胱壁內(nèi)具有較多微小血管生成。結(jié)論:負(fù)載有ATE的PLCL納米纖維補片具有較好的力學(xué)特征和組織相容性。其運用于膀胱大面積修復(fù)時可促進尿路上皮的覆蓋、平滑肌的生長以及新血管的生成,可一定程度上地實現(xiàn)膀胱的解剖學(xué)和功能學(xué)修復(fù),在膀胱組織工程領(lǐng)域具有一定的研究價值和應(yīng)用潛力。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R318.16
【部分圖文】：

圖 1.1 ADSCs 光鏡下形態(tài)（A. 原代 ADSCs；B. ADSCs 融合；bar=50 m）SCs 的表面抗原鑒定 P3 代 ADSCs 進行流式細(xì)胞術(shù)表面抗原檢測，結(jié)果如圖 1.2。間充質(zhì)干抗原標(biāo)志物 CD29、CD44、CD90 表達(dá)呈陽性，表達(dá)率分別為 99.6%、血細(xì)胞相關(guān)表面抗原 CD34、淋巴細(xì)胞相關(guān)表面抗原 CD44 表達(dá)呈陰性為 5.3%和 4.9%，符合間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原特征。CD29 CD44 CD90B CDE

圖 1.1 ADSCs 光鏡下形態(tài)（A. 原代 ADSCs；B. ADSCs 融合；bar=50 m）1.2 ADSCs 的表面抗原鑒定取 P3 代 ADSCs 進行流式細(xì)胞術(shù)表面抗原檢測，結(jié)果如圖 1.2。間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)表面抗原標(biāo)志物 CD29、CD44、CD90 表達(dá)呈陽性，表達(dá)率分別為 99.6%、99.5%、99.8%，血細(xì)胞相關(guān)表面抗原 CD34、淋巴細(xì)胞相關(guān)表面抗原 CD44 表達(dá)呈陰性，表達(dá)率分別為 5.3%和 4.9%，符合間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原特征。A BA B C

圖 1.3 BMSCs 光鏡下形態(tài)（A. 原代 BMSCs；B. BMSCs 融合；bar=50 m）SC 的表面抗原鑒定 P3 代 BMSCs 進行流式表抗檢測，結(jié)果如圖 1.4。間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)表CD44、CD90 表達(dá)呈陽性，表達(dá)率分別為 94.9%、85.4%、95.6%， 達(dá)呈陰性，表達(dá)率分別為 10.5%和 10.0%，符合間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗CD29 CD44 CD90B CD E
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本文編號：2850678