近年來(lái),聚合物越來(lái)越廣泛地被用作制備生物芯片的基底物質(zhì)。重要的是這些材料能被用于多種領(lǐng)域。聚合物具有眾多優(yōu)勢(shì)比如低成本,堅(jiān)固結(jié)構(gòu),易于構(gòu)造,快速成型。使用聚合物基質(zhì)一個(gè)重要的優(yōu)點(diǎn)是它們提供了各種各樣的表面性能,在某種情況下還能保留聚合物原有的性能。聚合物生物芯片制備技術(shù)是一種真正能代替普通玻璃基微陣列的技術(shù)。DNA微陣列體系通常是格式化的微型DNA探針,DNA芯片將有助于診斷和治療的結(jié)合以及引入個(gè)性化的藥物。生物分子的固定方法分為三類,基于共價(jià)結(jié)合,物理吸附,或者綁定相互作用的親和力。共價(jià)結(jié)合常以氨基為基礎(chǔ)。大多數(shù)用于綁定的機(jī)理依靠于N-羥基丁二酰亞胺(NHS),環(huán)氧基樹(shù)脂,醛類,或者碳二酰亞胺,這些都能與生物分子上的氨基共價(jià)結(jié)合。本課題探討了不同的共價(jià)結(jié)合方法用于在聚合物表面固定DNA,這對(duì)提高監(jiān)測(cè)靈敏性和用于特定生物分析的生物芯片的選擇性具有重要意義�；谝陨涎芯勘尘拔覀冏隽巳缦鹿ぷ鳎�1、基于光催化氧化法在環(huán)烯烴共聚物(COC)表面固定DNACOC有很多優(yōu)良的特性,包括高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度,低自體熒光,光學(xué)透明性和耐有機(jī)溶劑等。本研究中,我們使用一種新穎的方法將環(huán)氧基引入到COC表面,基于光催化氧化法(CPO)。首先,利用CPO方法將硫酸根陰離子引入到COC表面,然后硫酸根陰離子通過(guò)水解作用轉(zhuǎn)化成羥基,形成類玻璃表面,之后可以與硅烷偶聯(lián)劑反應(yīng)。我們選用環(huán)氧丙基三甲氧基硅烷將環(huán)氧基引入到COC薄膜表面,結(jié)果用XPS,水接觸角測(cè)量?jī)x和原子力顯微鏡表征。通過(guò)DNA末端的氨基與引入到COC表面的環(huán)氧基之間的共價(jià)結(jié)合實(shí)現(xiàn)DNA探針在COC表面的固定。不同濃度的DNA探針在COC表面的固定效率在45%～65%之間,與傳統(tǒng)的環(huán)氧化玻片相比相差無(wú)幾。得到的DNA微陣列與互補(bǔ)的靶基因?qū)崿F(xiàn)了成功雜交,雜交后熒光強(qiáng)度是由固定探針的密度或者雜交反應(yīng)液中靶基因的濃度決定。該方法在低成本的聚合物芯片的構(gòu)造中有相當(dāng)大的潛力。2、EVA表面三維微陣列芯片的構(gòu)造EVA是一種被廣泛使用的乙烯共聚物,在EVA中極性的乙烯醋酸酯單元無(wú)規(guī)分散在結(jié)構(gòu)中,使得EVA具有良好的柔韌性,光透過(guò)性能,并粘附其他有機(jī)／無(wú)機(jī)材料。首先作為光引發(fā)劑的異丙基硫雜蒽酮(ITX)在紫外光下引發(fā)共價(jià)結(jié)合到EVA表面形成異丙基硫雜蒽酮半頻哪醇(ITXSP)休眠基。固定在聚合物表面的ITXSP可作為一種反應(yīng)片段來(lái)引發(fā)乙烯基單體在可見(jiàn)光下的接枝。帶有環(huán)氧基的甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)被用作在EVA表面引入環(huán)氧基的功能性單體。首先在EVA表層可見(jiàn)光輻照接枝一層PEGDA抗污染層,再在表面二次可見(jiàn)光接枝一層功能性的微陣列。用3D結(jié)構(gòu)制備DNA微陣列具有很重要的優(yōu)勢(shì)：有更高固定能力的同時(shí)在固定分子之間有更長(zhǎng)的間距。利用一系列的表征方法證明EVA表面成功引入環(huán)氧基同時(shí)獲得了更親水的表面特性。利用原子力顯微鏡可以觀察到二次可見(jiàn)光接枝GMA與PEGDA混合物的EVA表面有規(guī)整的帶有一定高度的三維環(huán)氧反應(yīng)柱,之后帶有氨基的DNA探針與反應(yīng)柱上的環(huán)氧基共價(jià)結(jié)合,利用掃描儀檢測(cè)到EVA表面成功固定上了DNA。這為之后的基因檢測(cè)以及更廣泛的生物應(yīng)用提供了有利因素。3、利用原位光聚合方法在LDPE表面固定DNA及雜交檢測(cè)三維水凝膠微芯片的性能相對(duì)于二維平面微陣列芯片的優(yōu)點(diǎn)是固定能力高,固定分子周圍有均勻的水環(huán)境,固定化分子與疏水的基質(zhì)表面沒(méi)有接觸,因此增加了芯片固定探針的穩(wěn)定性。本研究開(kāi)發(fā)了一種新的共聚過(guò)程用于三維凝膠反應(yīng)柱的新型微芯片制備。使用氨基化的DNA,單體選用丙烯酰胺,氨基化的DNA能結(jié)合到增長(zhǎng)的聚丙烯酰胺鏈上,首先將氨基化的DNA與形成凝膠的丙烯酰胺單體混合,之后用點(diǎn)樣儀將聚合反應(yīng)的混合物的液滴噴點(diǎn)到LDPE表面進(jìn)行UV輻照引發(fā)DNA與丙烯酰胺之間的共聚合反應(yīng)。結(jié)果顯示DNA固定前后的固定效率大于80%,說(shuō)明利用該方法DNA成功地引入到了LDPE表面。LDPE表面固定的凝膠柱的力學(xué)和熱學(xué)性能都很穩(wěn)定。這為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。目前臨床上檢測(cè)膠質(zhì)瘤病變級(jí)數(shù)的方法比較復(fù)雜而且不準(zhǔn)確,利用上述方法制備的LDPE凝膠固定DNA微芯片檢測(cè)膠質(zhì)瘤病變級(jí)數(shù),25條特異性的膠質(zhì)瘤分級(jí)相關(guān)基因作為探針與從膠質(zhì)瘤組織中提取的DNA探針進(jìn)行雜交,觀察雜交情況確定病變級(jí)數(shù)。本研究使用一級(jí)和四級(jí)病變級(jí)數(shù)的膠質(zhì)瘤組織,先從組織中提取RNA,然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA,并用Cy3或者Cy5熒光標(biāo)記cDNA(靶基因),利用紫外分光光度計(jì)得到的紫外譜圖出現(xiàn)了cDNA的特征吸收峰說(shuō)明Cy3和Cy5成功標(biāo)記在cDNA上。cDNA作為靶基因與25條特異性DNA探針雜交,用掃描儀觀測(cè)到了明顯的雜交結(jié)果。通過(guò)該方法我們可以利用雜交結(jié)果以及熒光強(qiáng)度的不同來(lái)確定未知的病變程度用于早期的疾病檢測(cè)。
【學(xué)位單位】：北京化工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R318.08;Q789
【文章目錄】：
摘要
abstract
符號(hào)說(shuō)明
第一章 緒論
    1.1 在聚合物基材表面構(gòu)造DNA微陣列
    1.2 聚合物表面固定DNA的其他應(yīng)用
    1.3 無(wú)機(jī)材料上DNA微陣列的制備
    1.4 環(huán)烯烴共聚物(COC)在微流體芯片中的應(yīng)用
    1.5 環(huán)烯烴共聚物(COC)在其他領(lǐng)域的應(yīng)用
    1.6 EVA在多種領(lǐng)域中的應(yīng)用
    1.7 本論文的創(chuàng)新點(diǎn)及主要研究?jī)?nèi)容
第二章 利用光催化氧化法在COC表面固定DNA
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)部分
        2.2.1 試劑
        2.2.2 儀器
        2.2.3 COC表面環(huán)氧化
        2.2.4 DNA固定
        2.2.5 DNA雜交
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 表面表征
        2.3.2 DNA的固定
        2.3.3 DNA雜交分析
    2.4 結(jié)論
第三章 EVA表面三維圖案化固定DNA探針
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)部分
        3.2.1 試劑
        3.2.2 儀器
        3.2.3 EVA表面引入ITX
        3.2.4 EVA-ITX表面引入PEG刷
        3.2.5 在PEG刷表面引入環(huán)氧基反應(yīng)柱
        3.2.6 EVA表面的DNA微陣列
        3.2.7 表征
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 表面表征
        3.3.2 不同因素對(duì)環(huán)氧反應(yīng)柱高度的影響
        3.3.3 DNA在微陣列上的固定
    3.4 結(jié)論
第四章 原位光聚合制備基因芯片及雜交檢測(cè)
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)部分
        4.2.1 試劑
        4.2.2 儀器
        4.2.3 LDPE基材表面引入活性休眠基
        4.2.4 LDPE表面引發(fā)活性接枝聚合PEGDA
        4.2.5 LDPE表面微陣列構(gòu)造
        4.2.6 膠質(zhì)瘤組織中RNA的提取
            4.2.6.1 膠瘤組織中RNA的提取和純化
            4.2.6.2 利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA進(jìn)行純度完整性分析
        4.2.7 cDNA的雙鏈化以及純化
            4.2.7.1 合成雙鏈cDNA
            4.2.7.2 純化合成的雙鏈cDNA
        4.2.8 線性擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄合成cRNA
        4.2.9 反轉(zhuǎn)錄成cDNA并熒光標(biāo)記
            4.2.9.1 標(biāo)記反應(yīng)
            4.2.9.2 熒光物質(zhì)的摻入量
        4.2.10 將上述熒光標(biāo)記的cDNA與凝膠微陣列芯片上的DNA探針雜交
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 LDPE表面引入ITX
        4.3.2 LDPE-PEGDA表面DNA探針?lè)磻?yīng)液的鋪展性
        4.3.3 LDPE表面DNA三維凝膠微陣列的構(gòu)造
        4.3.4 提取的RNA與反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA的檢測(cè)
            4.3.4.1 組織中提取出的總RNA的定量及純度檢測(cè)
            4.3.4.2 線性擴(kuò)增后得到的cRNA的檢測(cè)
            4.3.4.3 反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA的定量和熒光標(biāo)記
        4.3.5 LDPE凝膠微陣列芯片上膠質(zhì)瘤病變基因檢測(cè)
    4.4 結(jié)論
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
研究成果及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
作者簡(jiǎn)介
導(dǎo)師簡(jiǎn)介
附件


本文編號(hào)：2849073