本文第一部分以天然蠶絲為載體,表面改性后用作捕獲器捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC),并對(duì)其捕獲性能進(jìn)行了研究。基于蠶絲和殼聚糖良好的生物相容性和各自的反應(yīng)活潑性,嘗試將兩者聯(lián)用,采用滴注的方法將殼聚糖覆膜在蠶絲表面,使蠶絲表面帶有大量活性氨基,再通過(guò)碳二亞胺法依次連接聚丙烯酸(PAA)和核酸適配體(Apt)構(gòu)建成捕獲蠶絲。將其固定在靜脈留置針中,前端伸出2厘米改性蠶絲用于捕獲。以蠕動(dòng)泵構(gòu)建循環(huán)系統(tǒng),模擬體內(nèi)血液循環(huán),將細(xì)胞懸液加入循環(huán)體系中考察捕獲器的捕獲性能。由于此覆膜方法得到的殼聚糖膜在蠶絲上分布較少且不均勻,捕獲結(jié)束后在覆膜部位可見(jiàn)明顯的細(xì)胞堆積,而在無(wú)膜部位則少見(jiàn)細(xì)胞,造成整體的捕獲效率不高。為提升捕獲效率,利用蠶絲蛋白中氨基酸分子側(cè)鏈上的氨基和羧基等基團(tuán),通過(guò)環(huán)氧鍵的開(kāi)環(huán)反應(yīng)接枝上1,4 丁二醇二縮水甘油醚(MSDS),使蠶絲表面帶上一層均勻的活性環(huán)氧鍵,再通過(guò)開(kāi)環(huán)反應(yīng)連接上長(zhǎng)鏈PAA,最后通過(guò)碳二亞胺法連接Apt。各步反應(yīng)均以傅里葉紅外變換光譜儀及掃描電鏡進(jìn)行表征。本章重新構(gòu)建了循環(huán)捕獲系統(tǒng)用于體外模擬,考察了此改性絲的捕獲效率及特異性。此捕獲器捕獲效率較好,特異性較高。實(shí)驗(yàn)中還研究了不同數(shù)量蠶絲對(duì)捕獲效果的影響,發(fā)現(xiàn)蠶絲數(shù)量越多,捕獲效果越好,近似呈指數(shù)形式增長(zhǎng),在蠶絲數(shù)量足夠的情況下,將展現(xiàn)出極強(qiáng)的捕獲能力。另測(cè)試了該捕獲器的細(xì)胞毒性和生物相容性,其僅有極輕的細(xì)胞毒性,不造成溶血和凝血,說(shuō)明其具有用于體內(nèi)捕獲癌細(xì)胞的潛質(zhì)。本文第二部分對(duì)聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)與基于細(xì)胞的指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Cell-SELEX)聯(lián)用方法進(jìn)行了研究,嘗試以細(xì)胞凝膠毛細(xì)管電泳進(jìn)行靶細(xì)胞的核酸適體篩選。實(shí)驗(yàn)中捕獲器捕獲CTC建立在適體識(shí)別并結(jié)合癌細(xì)胞的基礎(chǔ)上,一種適體僅特異性識(shí)別某種特定的癌細(xì)胞,尚有大量的癌細(xì)胞有待篩選出各自的特異性核酸適配體。傳統(tǒng)的適體篩選耗時(shí)較長(zhǎng),且操作復(fù)雜,因此本文提出一種新方法,并對(duì)該新型的、快速的篩選技術(shù)完成了初步的可行性研究,為進(jìn)一步的研究工作提供了良好的基礎(chǔ)。將靶細(xì)胞與聚丙烯酰胺膠混合后注入涂層毛細(xì)管內(nèi),使細(xì)胞凝膠在毛細(xì)管柱內(nèi)聚合,以嵌入式熒光激發(fā)模式檢測(cè)信號(hào),將FAM標(biāo)記的原始文庫(kù)電進(jìn)樣進(jìn)入細(xì)胞凝膠毛細(xì)管柱內(nèi)電泳分離。對(duì)聚丙烯酰胺膠的類型、濃度,電泳電壓,和進(jìn)樣時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化,決定電泳條件為:10%非交聯(lián)聚丙烯酰胺膠,電泳電壓400V/cm,電進(jìn)樣時(shí)間20s。在進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn),由于細(xì)胞表面的蛋白種類豐富,數(shù)量眾多,電泳中同一種ssDNA由于接觸到的蛋白種類和數(shù)量各不相同,在各個(gè)保留時(shí)間都有出現(xiàn),因此并不能簡(jiǎn)單地根據(jù)信號(hào)峰的先后判斷ssDNA與細(xì)胞的親和力強(qiáng)弱,即親和力存在差異的ssDNA鏈無(wú)法分開(kāi)。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R318
【部分圖文】：

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圖３．靜脈留置針捕獲示意圖［５２］??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2839872