豬是異種器官移植的優(yōu)良供體,但從豬到靈長類的異種器官移植中,會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng),這也是異種器官移植研究中亟待解決的難題。敲除α-1,3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)供體豬的制備,基本解決了異種器官移植超急性免疫排斥反應(yīng)。但補(bǔ)體介導(dǎo)的排斥反應(yīng),仍是機(jī)體排斥外源移植物的主要方式之一。高效表達(dá)人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白(Human complement regulatory protein,hCRP)基因hCD55、hCD46等,能有效地降低異種器官移植的免疫排斥反應(yīng)。本研究采用隨機(jī)整合的方法,在轉(zhuǎn)入人膜輔助因子蛋白(Membrane cofactor protein,MCP)基因hCD46的GTKO巴馬五指山雜交小型豬(Sus scrofa)耳成纖維細(xì)胞的基礎(chǔ)上,轉(zhuǎn)入人衰變加速因子(Decay accelerating factor)hCD55基因,獲得了hCD55轉(zhuǎn)基因豬1頭;又采用定點(diǎn)敲入的方法,利用GTKO巴馬小型豬耳成纖維細(xì)胞,轉(zhuǎn)入hCD55基因,以期制備高效表達(dá)DAF的定點(diǎn)整合hCD55的耳成纖維細(xì)胞系。具體研究結(jié)果如下:1.轉(zhuǎn)hCD55和hCD46克隆豬制備利用GTKO/hCD46巴馬五指山雜交豬的耳成纖維細(xì)胞系,將人衰變加速因子蛋白基因hCD55隨機(jī)整合到豬基因組中,制備表達(dá)人雙補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的異種移植供體豬。構(gòu)建廣泛性表達(dá)啟動(dòng)子CAG調(diào)控的hCD55基因表達(dá)載體pCAGhCD55,轉(zhuǎn)染豬耳成纖維細(xì)胞,嘌呤霉素篩選陽性細(xì)胞52個(gè)。PCR鑒定目的基因hCD55的整合情況,獲得整合hCD55基因的克隆點(diǎn)27個(gè)。RT-PCR鑒定目的基因hCD55的表達(dá)情況,表達(dá)hCD55的克隆點(diǎn)有17個(gè)。選取表達(dá)較高的克隆點(diǎn)細(xì)胞,利用體細(xì)胞核移植技術(shù)制備hCD55轉(zhuǎn)基因豬,選取596個(gè)融合胚胎移植4頭代孕母豬,獲得陽性仔豬1頭。PCR鑒定克隆仔豬基因型(genotype),克隆仔豬成功整合hCD55基因。RT-PCR鑒定hCD55、hCD46的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,hCD55、hCD46基因在仔豬體內(nèi)能正常表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)hCD55在轉(zhuǎn)基因豬的各個(gè)器官中的表達(dá)量,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)hCD55基因在克隆仔豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胰臟、肌肉、小腸和大腸等器官都有表達(dá),在肝臟、肺臟、腎臟中的表達(dá)水平較高。2.豬Rosa26位點(diǎn)敲入Loxp修飾的hCD55成纖維細(xì)胞系的建立高效表達(dá)人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白基因hCD55,在異種器官移植中尤為重要。本研究在GGTA1基因敲除(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)巴馬小型豬(Sus scrofa)耳成纖維細(xì)胞的基礎(chǔ)上,利用CRISPR/Cas9技術(shù)在豬Rosa26基因座敲入hCD55基因,以制備hCD55基因高效表達(dá)的細(xì)胞系。分別構(gòu)建靶向切割pRosa26(Reverse orientation splice acceptorβ-geo26,Rosaβgeo26)位點(diǎn)intron 1(內(nèi)含子1)的Cas9表達(dá)載體,及pRosa26位點(diǎn)同源重組hCD55的表達(dá)載體,后者包含異源Loxp序列間的EF1α(polypeptide chain elongation factor 1α)啟動(dòng)子調(diào)控的hCD55基因、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(hygromycin B phosphotransferase,HPH)基因、胸腺激酶(thymidine kinase,TK)基因?yàn)檎?fù)篩選基因。將Cas9-Rosa26表達(dá)載體和pEF1α-hCD55表達(dá)載體共電轉(zhuǎn)染豬耳成纖維細(xì)胞系,培養(yǎng)液中加入丙氧鳥苷(Ganciclovir,GCV)和潮霉素(Hygromycin,Hyg)進(jìn)行篩選,培養(yǎng)至單細(xì)胞克隆,獲得94個(gè)克隆點(diǎn)。利用跨5’端和3’端同源臂的兩對(duì)引物PCR檢測(cè)目的基因整合情況,定點(diǎn)整合hCD55的陽性克隆點(diǎn)2個(gè)。RT-PCR和Western blot檢測(cè)hCD55在細(xì)胞中的表達(dá)情況,陽性細(xì)胞都能正常表達(dá)hCD55基因。結(jié)論:本研究利用GTKO/hCD46巴馬五指山雜交豬的耳成纖維細(xì)胞系,成功制備了GTKO/hCD46/hCD55表達(dá)人雙補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的異種移植供體豬;在GTKO巴馬小型豬耳成纖維細(xì)胞系基礎(chǔ)上,成功構(gòu)建了定點(diǎn)整合并表達(dá)目的基因hCD55的細(xì)胞系。驗(yàn)證了克隆實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的穩(wěn)定性,為異種移植供體豬的制備提供了資料基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q78;R318
【部分圖文】：

CR 分析仔豬各器官 hCD55 的表達(dá)轉(zhuǎn)基因克隆仔豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胰腺、肌肉、小官總RNA，反轉(zhuǎn)200ng的RNA，使用目的基因引物hCD55-q-F5/R5，因，在相同條件下進(jìn)行qPCR檢測(cè)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法[87]進(jìn)行相對(duì)表和GAPDH基因的qPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：cDNA(10 ng/μL) 2μL，Sx酶 10μL，上下游引物各1μL，ddH2O6μL。qPCR反應(yīng)條件：95℃ 1min，31個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。與分析G-hCD55 載體驗(yàn)證AG-hCD55 載體測(cè)序結(jié)果顯示，其各組成元件序列均正確，目的基因骨架連接正確，表明本研究成功構(gòu)建了 pCAG-hCD55 表達(dá)載體(圖

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆碩士學(xué)位論文圖 2 pCAGGS-hCD55-Puro 表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 The structure diagram of pCAGGS-hCD55-Puro expression vector克隆點(diǎn)細(xì)胞 DNA 整合鑒定結(jié)果克隆點(diǎn)細(xì)胞 5×103左右，裂解法提 DNA，PCR 鑒定目的基因 hCD5況。部分鑒定結(jié)果如圖 3 所示，可初步篩選出陽性克隆點(diǎn)細(xì)胞。M D34 D35 D36 D37 D38 D39 D40 D42 D43 D44bp0

圖 3 部分陽性克隆點(diǎn)細(xì)胞的 RT-PCR 鑒定Fig.3 Detection of hCD55 gene by RT-PCR with a part of positive cells注：M:DL2000 DNALadder；D37、D42：陽性細(xì)胞克隆點(diǎn)Note: M: DL2000 DNALadder；D37、D42：The positive cells2.4 轉(zhuǎn)基因克隆胚胎移植效率檢測(cè)參照表 2，從 6 個(gè) hCD55 基因表達(dá)級(jí)別為 A 的細(xì)胞克隆點(diǎn)中選用生長狀況良好的陽性細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植，共挑選了 596 枚融合胚胎移植到 4 頭代孕母豬，4 個(gè)月后獲得 hCD55 轉(zhuǎn)基因克隆豬 1 頭，結(jié)果如表 3 所示。表 3 轉(zhuǎn)基因克隆胚胎移植后的出生結(jié)果Table 3 Birth outcome after transplant of transgenic reconstructed embryos受體母豬編號(hào)Recipients serial number移植胚胎數(shù)Transplant reconstructed embryos產(chǎn)仔數(shù)Litter size8-37 85 08-38 144 0
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本文編號(hào)：2835162