研究目的:近年來的組織工程學(xué)類器官研究為1型糖尿病的治療提供了工程學(xué)依據(jù)和新思路。類器官作為一種體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),可分化為多個(gè)器官特異性的細(xì)胞類型,具有和其對(duì)應(yīng)的器官所類似的空間結(jié)構(gòu),并能夠重現(xiàn)對(duì)應(yīng)器官的部分功能。靜電紡絲生物支架具有微米或納米級(jí)紡絲結(jié)構(gòu),能夠作為細(xì)胞生長(zhǎng)、分化的載體,模擬細(xì)胞外基質(zhì),為細(xì)胞提供生長(zhǎng)空間,對(duì)于胰島類器官培養(yǎng)系統(tǒng)的建立具有組織工程學(xué)意義。為了能夠穩(wěn)定提供促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的生長(zhǎng)因子,本研究通過材料表面聚多巴胺改性粘附方法,制備負(fù)載艾塞那肽的明膠聚乳酸靜電紡絲纖維膜,用于誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化,觀察材料表面細(xì)胞增殖能力和相容性,測(cè)定其胰島素分泌功能,旨在為胰島樣類器官的研究提供組織工程體系實(shí)驗(yàn)依據(jù),并提供糖尿病治療的新思路。研究方法:本研究使用靜電紡絲技術(shù)制備明膠聚乳酸靜電紡絲纖維膜支架,通過材料表面聚多巴胺改性粘附方法得到聚多巴胺改性的明膠聚乳酸靜電紡絲膜,進(jìn)而制備負(fù)載艾塞那肽的明膠聚乳酸靜電紡絲纖維膜。通過紅外光譜測(cè)定方法分析負(fù)載艾塞那肽的明膠聚乳酸靜電紡絲纖維膜的化學(xué)組成。使用掃描電鏡、接觸角測(cè)定等方法,對(duì)三種支架材料進(jìn)行理化性質(zhì)評(píng)價(jià)。為了評(píng)價(jià)負(fù)載艾塞那肽靜電紡絲膜支架的細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞相容性,并應(yīng)用于進(jìn)一步的誘導(dǎo)分化,本實(shí)驗(yàn)分離并培養(yǎng)大鼠原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,流式細(xì)胞檢測(cè)其表型以鑒定其純度。體外利用負(fù)載艾塞那肽靜電紡絲膜支架接種培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,掃描電鏡觀察材料表面細(xì)胞形貌,檢測(cè)細(xì)胞增殖水平,分析各紡絲膜的生物相容性。結(jié)果顯示,負(fù)載艾塞那肽靜電紡絲膜具有較好的生物相容性和細(xì)胞增殖能力。本實(shí)驗(yàn)使用負(fù)載艾塞那肽明膠聚乳酸靜電紡絲膜接種培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,選擇國內(nèi)外使用較為廣泛的三步法對(duì)接種于復(fù)合膜材料的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行胰島素分泌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。通過雙硫腙染色、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫熒光和ELISA方法,檢測(cè)所得細(xì)胞的胰島素、C肽、PDX-1、PAX-4、GLUT2等胰島素相關(guān)的關(guān)鍵基因和蛋白的表達(dá)。研究結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)通過紅外光譜測(cè)定,證實(shí)了聚多巴胺改性方法制備的聚多巴胺改性的明膠聚乳酸靜電紡絲膜上存在有聚多巴胺層,經(jīng)過二次改性,艾塞那肽能夠被負(fù)載于靜電紡絲膜上。對(duì)聚多巴胺改性的明膠聚乳酸靜電紡絲膜進(jìn)行BSA蛋白吸附量測(cè)定結(jié)果顯示,在反應(yīng)120分鐘時(shí)的BSA累計(jì)吸附量顯著增加,由此推算各孔中幾乎全部的艾塞那肽均能夠負(fù)載于聚多巴胺改性的明膠聚乳酸靜電紡絲膜上。接觸角測(cè)定結(jié)果顯示,與單純明膠聚乳酸膜相比,負(fù)載艾塞那肽明膠聚乳酸靜電紡絲膜的接觸角明顯減小�？梢酝茰y(cè),負(fù)載艾塞那肽明膠聚乳酸靜電紡絲膜的結(jié)構(gòu)比單純明膠聚乳酸靜電紡絲膜親水性更強(qiáng),更有利于細(xì)胞表面粘附。使用負(fù)載艾塞那肽明膠聚乳酸靜電紡絲復(fù)合膜接種培養(yǎng)培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,測(cè)定其細(xì)胞相容性和增殖水平。掃描電鏡和熒光染色結(jié)果顯示,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在負(fù)載艾塞那肽明膠聚乳酸靜電紡絲膜、聚多巴胺改性的明膠聚乳酸靜電紡絲膜和單純明膠聚乳酸膜上呈扁平生長(zhǎng),彌散分布,三種紡絲膜表面的細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)基本相同,表明負(fù)載艾塞那肽明膠聚乳酸靜電紡絲復(fù)合膜能夠?yàn)楣撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞提供了良好的細(xì)胞黏附支架環(huán)境。MTT比色法評(píng)價(jià)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在負(fù)載艾塞那肽明膠聚乳酸靜電紡絲復(fù)合膜上細(xì)胞增殖能力結(jié)果顯示,負(fù)載艾塞那肽明膠聚乳酸靜電紡絲復(fù)合膜和單純明膠聚乳酸膜均能支持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附和增殖,說明該支架具有較好的細(xì)胞相容性,且相同時(shí)間與單純明膠聚乳酸膜相比,MTT結(jié)果顯示一定程度上能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。以上結(jié)果與接觸角測(cè)定結(jié)果相一致。雙硫腙定性染色結(jié)果顯示,無支架誘導(dǎo)的胰島素分泌細(xì)胞上觀察到被雙硫腙染為紅棕色的團(tuán)狀胰島素表達(dá)細(xì)胞,同時(shí)存在不規(guī)則形態(tài)的細(xì)胞表現(xiàn)為紅棕色陽性表達(dá),間接表現(xiàn)所得細(xì)胞能夠產(chǎn)生富含鋅離子的胰島素顆粒�？梢酝茰y(cè),采用三步法體外誘導(dǎo)鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化細(xì)胞能夠具有胰島素表達(dá)功能,因此將此方法使用于負(fù)載艾塞那肽靜電紡絲膜誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,和常規(guī)無支架誘導(dǎo)的胰島素分泌細(xì)胞相比,負(fù)載艾塞那肽的靜電紡絲膜對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化具有一定促進(jìn)作用,其機(jī)制可能與提高PDX-1、Pax-4、glut2的表達(dá)相關(guān)。免疫熒光檢測(cè)和ELISA結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證,與無支架誘導(dǎo)胰島素分泌細(xì)胞和對(duì)照組未誘導(dǎo)鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比,負(fù)載艾塞那肽明膠聚乳酸靜電紡絲復(fù)合膜誘導(dǎo)胰島素分泌細(xì)胞中胰島素、C肽、PDX-1的相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯升高(P均0.05)。通過免疫熒光定性檢測(cè)和半定量測(cè)定結(jié)果顯示,和常規(guī)無支架誘導(dǎo)的胰島素分泌細(xì)胞相比,負(fù)載艾塞那肽的靜電紡絲膜能夠提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的胰島素表達(dá)水平,對(duì)其誘導(dǎo)分化具有一定促進(jìn)作用,其機(jī)制可能與提高PDX-1蛋白表達(dá)量相關(guān)。結(jié)論:(1)使用多巴胺改性方法,艾塞那肽能夠被負(fù)載于明膠聚乳酸靜電紡絲膜上且吸附率較高。(2)負(fù)載艾塞那肽明膠聚乳酸靜電紡絲復(fù)合膜結(jié)構(gòu)與單純明膠聚乳酸膜相比,親水性更強(qiáng),更有利于細(xì)胞表面粘附。(3)掃描電鏡和鈣黃綠素染色結(jié)果顯示,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在負(fù)載艾塞那肽明膠聚乳酸靜電紡絲復(fù)合膜上較好粘附和鋪展生長(zhǎng)。(4)MTT結(jié)果顯示負(fù)載艾塞那肽明膠聚乳酸靜電紡絲復(fù)合膜一定程度上能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。(5)和常規(guī)無支架誘導(dǎo)的胰島素分泌細(xì)胞相比,負(fù)載艾塞那肽的靜電紡絲膜能夠提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的胰島素表達(dá)水平,對(duì)其誘導(dǎo)分化具有一定促進(jìn)作用。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R587.1;R318.08
【部分圖文】：

本研究技術(shù)路線示意圖

乳酸(Poly-L-lactic-acid, PLLA, Mw = 30000)，分別加入上膠的 10ml 溶劑，37-40℃水浴條件下，使用磁力攪拌器 10 ml 已溶有明膠的溶劑。依次配制為明膠：聚乳酸（w1P1)、2:1(G2P1)的不同濃度的聚合物溶液備用。酸靜電紡絲納米纖維膜：將混合溶液注入 5 毫升針頭注泵裝置對(duì)聚合物溶液進(jìn)行噴絲，推進(jìn)速度為 0.5 ml/小時(shí)V、15 KV、20 KV 高壓電源，測(cè)試不同電壓參數(shù)對(duì)纖維極與噴絲裝置相連接，電壓陰極與采集鋁箔相連接，采，采集距離約 20 cm，室溫下制備靜電紡絲纖維膜。為了的溶劑，將制備的靜電紡絲納米纖維膜在 37℃的真空干直徑 2.3 mm 或 0.9 mm 的圓形，紫外滅菌處理后無菌條中使用。圖 2.1 所示為靜電紡絲制備裝置。

以備后續(xù)不同實(shí)驗(yàn)中使用。圖 2.1 所示為靜電紡絲制備裝置。圖 2.1 靜電紡絲制備裝置示意圖2.2.3 不同條件制備靜電紡絲的理化檢測(cè)① 在 3kv 加速電壓條件下，用掃描電鏡（SEM）觀察支架的表面形貌。② 對(duì)掃面電鏡圖像進(jìn)行處理，每個(gè)區(qū)域統(tǒng)計(jì) 100 根纖維，利用 Image-Pro Plus軟件(Media Cybernetics, Rockville, MD, USA)對(duì)納米纖維的直徑分布進(jìn)行了定量測(cè)

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4 鄧儀昊;陳道邦;;胰島素分泌細(xì)胞的來源[J];四川解剖學(xué)雜志;2006年04期

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4 周光紀(jì);胚胎干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的誘導(dǎo)及糖尿病細(xì)胞移植治療的實(shí)驗(yàn)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2006年

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本文編號(hào)：2834418