目的:金屬鈦和鈦基合金憑借其優(yōu)良的耐腐蝕性、高機械強度和細胞相容性被廣泛應(yīng)用為各式的骨科植入物材料。除此之外,這些材料還具有優(yōu)越的疲勞強度、高耐磨性,以及與天然人體骨相似的楊氏模量。然而,骨科術(shù)后植入物相關(guān)感染和無菌性松動是骨科術(shù)后的2個主要挑戰(zhàn)。骨科術(shù)后植入物相關(guān)感染的發(fā)病機制是細菌粘附在內(nèi)植物表面、增殖以及隨后形成生物膜。形成的生物膜可以保護細菌免受宿主免疫系統(tǒng)和抗生素治療的影響,從而導(dǎo)致植入物相關(guān)感染。而假體與骨組織之間的結(jié)合失敗則可導(dǎo)致無菌性松動。但是,目前骨科常用的植入物材料-鈦缺乏抗菌能力和促骨整合性能。因此,迫切需要設(shè)計一種金屬植入物,可以同時防止植入物相關(guān)感染并且還促進骨整合以防術(shù)后無菌性松動。目前為了防治植入物相關(guān)感染的主要策略是通過離子注入,等離子噴涂,陽極氧化和抗生素涂層或抗菌聚合物對金屬鈦表面進行改性。其中無機抗菌金屬銀與傳統(tǒng)抗生素相比,具有抗菌譜廣、形成抗性菌株的可能性小,細胞毒性低和生理條件下令人滿意的穩(wěn)定性的特點。因此已被應(yīng)用于部分臨床中的醫(yī)療產(chǎn)品和器械中。在賦予金屬鈦抗菌性的方法中,除了用抗菌金屬銀離子或納米銀顆粒對金屬鈦表面進行改性之外,減少細菌感染發(fā)生的另一個重要策略是在金屬鈦中摻入具有抗菌能力的金屬銀。增強金屬鈦的骨整合能力的表面改性方法有很多。其中的酸蝕和堿處理是一種低成本的,有效的和再現(xiàn)度高的表面改性方法。通過酸蝕和堿處理后材料表面將形成獨特的微米,亞微米和納米復(fù)合結(jié)構(gòu)。在本研究中,分別通過放電等離子燒結(jié)方法和鑄造的方法制備鈦銀合金,之后對表面進行酸蝕或和堿處理進行表面改性。重點評價2種表面改性后的鈦銀合金的表征、抗菌性能、生物相容性及促成骨能力。研究方法:分別通過放電等離子燒結(jié)方法和鑄造方法制備2種鈦銀合金。對前者予以氫氟酸和硝酸混合酸蝕處理(Ti-Ag(AE)),對后者予以鹽酸酸蝕和氫氧化鈉堿處理(Ti-Ag(CT))。之后,系統(tǒng)的評價各樣品的表面特征、離子釋放情況、抗菌性能、生物相容性和促成骨性能等。通過場發(fā)射掃描電鏡觀察樣品表面形貌;通過能量色散X射線譜和X射線衍射分析表面化學(xué)組成;通過共聚焦激光掃描顯微鏡測定表面粗糙度;通過接觸角的測定評價樣品表面親水性;通過銀離子釋放測定,電化學(xué)分析和pH測定來研究樣品抗菌機制;通過平板涂布計數(shù)法分別檢測樣品1天和30天后的抗菌能力;通過活死細菌熒光染色和掃描電鏡觀察共培養(yǎng)1天后的細菌活性和細菌粘附程度;通過鬼筆環(huán)肽和DAPI染色檢測細胞的粘附情況;通過MTT或CCK-8方法對細胞活性和細胞增值情況進行分析;通過檢測堿性磷酸酶活性、成骨相關(guān)基因的表達水平和細胞外基質(zhì)礦化水平來評價樣品的促成骨能力;通過構(gòu)建大鼠股骨與內(nèi)植物相關(guān)的骨髓炎感染模型,采用X線拍攝和內(nèi)植物取出滾板來評價樣品在動物體內(nèi)的抗感染作用。結(jié)果:采用放電等離子燒結(jié)方法制備的鈦銀合金在酸蝕處理之后,在Ti-Ag(AE)樣品的表面上形成微坑和具有高銀含量顆粒,Ti-Ag(AE)樣品表面上的顆粒含有顯著高于基底的銀含量,并且由Ti_2Ag和Ti-Ag金屬間化合物組成。鈦銀燒結(jié)合金酸蝕處理后的粗糙度明顯增加(p0.01),且經(jīng)酸蝕處理鈦銀燒結(jié)合金的親水性大于未酸蝕的樣品(p0.05),除了Ti-5Ag(AE)。在銀離子釋放方面,Ti-Ag(AE)樣品最初釋放出大量的銀離子,然后釋放量逐漸減少,釋放量均高于未酸蝕的鈦銀燒結(jié)合金。電化學(xué)實驗結(jié)果顯示Ti-Ag(AE)樣品具有比cp-Ti和s-Ti(AE)樣品更好的耐腐蝕性,但耐腐蝕性比鈦銀燒結(jié)合金樣品差。在體外抗菌性實驗中,通過平板涂布法檢測,與沒有酸蝕的鈦銀燒結(jié)合金樣品相比,酸蝕過的鈦銀燒結(jié)合金樣品無論在第1天還是磷酸鹽緩沖鹽水中浸泡30天后都具有顯著更好的抗菌率(p0.01),其中Ti-3Ag(AE)和Ti-5Ag(AE)即使在浸泡30天后的抗菌率仍分別保持在96.53%和99.04%。活死細菌熒光染色和掃描電子顯微鏡下觀察結(jié)果皆證實,Ti-3Ag(AE)和Ti-5Ag(AE)樣品不僅可以有效殺滅粘附的細菌,還可以防止細菌粘附。在體外生物相容性實驗中,MC3T3-E1細胞的細胞活力和增殖結(jié)果顯示Ti-Ag(AE)樣品無細胞毒性,但也沒有促進細胞增殖的能力(p0.05)。通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)在細胞與樣品共培養(yǎng)1天后,酸蝕處理過的樣品會伸出更多的偽足,而共培養(yǎng)三天后各樣品之間的形態(tài)差異并不明顯。在cp-Ti和Ti-Ag(AE)之間的堿性磷酸酶活性并無無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05),表明Ti-Ag(AE)對細胞分化沒有影響。采用鑄造方法制備的鈦銀合金在酸蝕和堿處理(合稱化學(xué)處理)之后,Ti-Ag(CT)樣品的表面顯示出微米級、亞微米級和納米級混合復(fù)合結(jié)構(gòu)和微米級與亞微米級顆粒。通過能量色散X射線光譜可分析出,堿處理導(dǎo)致在Ti-Ag樣品酸蝕處理后的表面上形成具有高銀含量的顆粒。X射線衍射檢測到在化學(xué)處理的樣品上存在ɑ-Ti和TiH_2。Ti-Ag(CT)樣品的粗糙度和親水性顯著高于cp-Ti樣品(p0.01)。Ti-1Ag(CT),Ti-3Ag(CT)和Ti-5Ag(CT)樣品第1天的銀離子釋放量分別為21.20±4.92,45.37±4.56和145.17±11.70ppb。鈦銀樣品在第1天釋放相對大量的銀離子,然后釋放量逐漸減少,在7天后達到穩(wěn)定。且第一天的pH值均在6-7范圍內(nèi)。在體外抗菌性實驗中,通過平板涂布法檢測,Ti-3Ag(CT)和Ti-5Ag(CT)樣品無論在第1天還是磷酸鹽緩沖鹽水中浸泡30天后都具有顯著更好的抗菌率(p0.01),其中Ti-3Ag(AE)和Ti-5Ag(CT)即使在浸泡30天后的抗菌率仍依然保持在90%以上�；钏兰毦鸁晒馊旧蛼呙桦娮语@微鏡下觀察結(jié)果皆證實,Ti-3Ag(CT)和Ti-5Ag(CT)樣品不僅可以有效殺滅粘附的細菌,還可以防止細菌粘附。在體外細胞實驗中,Ti-Ag(CT)樣品比在cp-Ti樣品上粘附的細胞更多(p0.05),且表現(xiàn)出來更多的細胞質(zhì)延伸,更多的絲狀偽足和片狀偽足。但在細胞增殖方面cp-Ti和Ti-Ag(CT)樣品之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。但通過對相對生長速率的計算證實Ti-Ag(CT)樣品都沒有細胞毒性。在促進細胞成骨的實驗中,成骨誘導(dǎo)7天后,Ti(CT),Ti-1Ag(CT)和Ti-3Ag(CT)樣品的堿性磷酸酶活性均高于cp-Ti樣品(p0.05)。在成骨相關(guān)基因表達方面,Ti-Ag(CT)可以促進前成骨細胞堿性磷酸酶,1型膠原蛋白和骨鈣素基因的表達。除此之外,Ti-Ag(CT)還可以促進細胞外基質(zhì)礦化。在動物體內(nèi)實驗中,術(shù)后7天和42天的X光影響均可在cp-Ti組發(fā)現(xiàn)內(nèi)植物感染的征象,而在Ti-3Ag(CT)組中則無任何感染征象。而且cp-Ti組內(nèi)植物取出后滾板培養(yǎng)會有大量菌落形成,而Ti-3Ag(CT)組內(nèi)植物取出后滾板培養(yǎng)無菌落形成。結(jié)論:采用放電等離子燒結(jié)系統(tǒng)制備鈦銀燒結(jié)合金樣品。酸蝕前的鈦銀燒結(jié)合金樣品的抗菌率有限且不令人滿意。在酸蝕處理之后,在Ti-Ag(AE)樣品的表面上形成微坑和具有高銀含量顆粒,并且Ti-3Ag(AE)和Ti-5Ag(AE)樣品顯示出優(yōu)異的抗菌性能。即使浸泡30天后,Ti-3Ag(AE)和Ti-5Ag(AE)樣品仍顯示出高于96%的抗菌率,表明它們具有長期有效的抗菌性。此外,Ti-3Ag(AE)和Ti-5Ag(AE)樣品也表現(xiàn)出良好的生物相容性。采用鑄造的方法制備鈦銀鑄造合金樣品�；瘜W(xué)處理后鈦銀鑄造合金表面形成了微米和亞微米混合孔隙、海綿狀納米結(jié)構(gòu)和含銀顆粒。Ti-1Ag(CT)、Ti-3Ag(CT)和Ti-5Ag(CT)樣品在24小時內(nèi)顯示出強抗菌性能,這歸功于銀離子釋放和含銀顆粒。Ti-3Ag(CT)和Ti-5Ag(CT)樣品在浸泡30天后仍保持抗菌性,這主要歸功于含銀顆粒。此外,Ti-1Ag(CT)和Ti-3Ag(CT)樣品由于其特殊的表面形貌,在細胞粘附和成骨分化方面均表現(xiàn)出促進作用。Ti-3Ag(CT)在動物體內(nèi)也可起到抗感染作用。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R318.08
【部分圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3 實驗結(jié)果.1 表征分析樣品 cp-Ti 和酸蝕處理之前和之后具有不同銀含量的 s-Ti（AE）和 Ti-Ag 燒結(jié)金的 XRD 結(jié)果如圖 1.1 所示。觀察到兩個不同的相：ɑ-Ti 和 Ti2Ag。 圖 1.2E-L示了 s-Ti（AE）和 Ti-Ag（AE）樣品的表面形態(tài)。與 cp-Ti 和 Ti-Ag 樣品的原始面相比（圖 1.2A-D），在圖 1.2E-L 發(fā)現(xiàn)具有不同尺寸的凹坑和顆粒的較粗糙的裂表面。凹坑的直徑在微米級尺度上并且不大于 5μm。這些顆粒具有不同的不規(guī)形狀，尺寸范圍從亞微米到微米（無>8μm）。隨著 Ti-Ag（AE）樣品中銀含量的加，表面上的凹坑數(shù)量減少，而顆粒在增多。

表面相比（圖 1.2A-D），在圖 1.2E-L 發(fā)現(xiàn)具有不同尺寸的凹坑和顆粒的較粗糙的裂縫表面。凹坑的直徑在微米級尺度上并且不大于 5μm。這些顆粒具有不同的不規(guī)則形狀，尺寸范圍從亞微米到微米（無>8μm）。隨著 Ti-Ag（AE）樣品中銀含量的增加，表面上的凹坑數(shù)量減少，而顆粒在增多。圖 1.1 cp-Ti，Ti-Ag，s-Ti（AE）和 Ti-Ag（AE）樣品的 XRD 結(jié)果。 A）未經(jīng)酸蝕處理的樣品。 B）經(jīng)過酸蝕處理的樣品。

C）Ti-3Ag，D）Ti-5Ag，E）和 I）s-Ti（AE），F(xiàn)）和 J）Ti-1Ag（AE），G）和 K）Ti-3Ag（AE），H）和 L）Ti-5Ag（AE）。通過能量色散X射線光譜測定酸蝕前的 Ti-Ag 燒結(jié)合金的銀含量分別為為1.22t％，2.94 wt％和 4.82 wt％。圖 1.3A 顯示 Ti-5Ag（AE）的放大倍數(shù)圖像，圖 1.3B- 顯示顆粒的元素分布圖像（區(qū)域 A）。通過能量色散 X 射線光譜（點模式）分析含量在顆粒內(nèi)變化，如圖 1.3B-D 所示。在同一顆粒內(nèi)，在 A 點檢測到約 67.25at％i 和 32.75 at％Ag，而在 B 點檢測到約 93.03 at％Ti 和 6.97 at％Ag（表 1.1）。在點 處 Ti 與 Ag 的原子比約為 2：1，這表明該部分顆粒對應(yīng)于在 XRD 圖中觀察到的i2Ag 相。另一顆粒中的 C 點含有 59.07 at％Ti 和 40.93 at％Ag，表明不同顆粒具有同的銀含量。根據(jù) EDS 和 XRD 結(jié)果，推斷出點 B 和 C 位于 Ti-Ag 金屬間化合物，且不形成具有化學(xué)計量比的化合物�？偟膩碇v，上述結(jié)果表明，Ti-Ag（AE）樣表面上的顆粒含有顯著高于基底的銀含量，并且由 Ti2Ag 和 Ti-Ag 金屬間化合物成。

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