細胞作為生命的基本單元,在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有重要的研究意義,也已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細胞治療、組織工程和藥物開發(fā)等領(lǐng)域。目前,超低溫冷凍保存(凍存)是細胞長期保存最可靠的手段,而凍存保護劑是成功實現(xiàn)超低溫保存的關(guān)鍵。然而當(dāng)前凍存保護劑的局限性,特別是細胞毒性,限制了凍存技術(shù)的發(fā)展。因此,開發(fā)高效無毒的新型凍存保護劑意義重大。我們發(fā)現(xiàn)天然滲透壓調(diào)節(jié)劑是廣泛存在于生物系統(tǒng)中的親水性分子,通常具有良好的生物相容性。因此,本文基于凍存損傷機理,提出天然滲透壓調(diào)節(jié)劑可能成為凍存保護劑的理想候選,并考察了它們的凍存保護效果。首先,本文對三種代表性天然滲透壓調(diào)節(jié)劑(脯氨酸、甘氨酸、�；撬�)的細胞毒性、細胞滲透壓調(diào)節(jié)能力和水溶液的熱力學(xué)性質(zhì)進行了研究,系統(tǒng)評價了它們的生物相容性、防止?jié)B透壓損傷和冰晶損傷的能力,發(fā)現(xiàn)脯氨酸能力最為突出。然后,采用超速凍存法實現(xiàn)了四種細胞系(GLC-82、LTEP-a-2、3T3、SMCs)的高效凍存,發(fā)現(xiàn)脯氨酸凍存效率最高,且顯著優(yōu)于傳統(tǒng)凍存保護劑DMSO�；谝陨蠈嶒灲Y(jié)果,本文進一步探討了凍存保護機理。其次,本文又將天然滲透壓調(diào)節(jié)劑用于紅細胞的超低溫凍存,并取得了良好的效果。其中脯氨酸的凍存效率最高,與調(diào)節(jié)紅細胞滲透壓的能力規(guī)律一致。溶血率、細胞形態(tài)等測試證明天然滲透壓調(diào)節(jié)劑可以迅速洗脫實現(xiàn)快速供血,具有良好的血液相容性。從而為解決當(dāng)前紅細胞“金標(biāo)準(zhǔn)”凍存保護劑甘油在洗脫過程中極易導(dǎo)致紅細胞溶血的難題提供了有力手段。最后,本文還開發(fā)了天然滲透壓調(diào)節(jié)劑與天然/合成聚合物的組合配方,進一步提高凍存保護效果,并初步探索它們的協(xié)同保護機理,為新一代凍存保護劑的開發(fā)提供了方向。
【學(xué)位單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R318
【部分圖文】：

刺傷細胞膜和細胞器，破壞細胞結(jié)構(gòu)的完整性，對細胞造成不可逆轉(zhuǎn)的機械物理損傷，這種損傷稱為冰晶損傷。在超低溫凍存過程中，滲透壓損傷和冰晶損傷往往是同時存在的。兩種凍存損傷的示意圖如圖1-1所示。圖1-1 超低溫細胞凍存損傷示意圖Figure 1-1 Schematic drawing of cryoinjuries in cell cryopreservation

具有很大的關(guān)系，是有潛力作為凍存保護劑的天然滲透壓調(diào)節(jié)劑的典型代表，也是本文的主要研究對象。脯氨酸、甘氨酸、�；撬岷统Ｓ脙龃姹Ｗo劑DMSO的分子結(jié)構(gòu)式如圖1-2所示。圖1-2 脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）、�；撬幔═au）和DMSO的分子結(jié)構(gòu)Figure 1-2 Molecular structures of Pro, Gly, Tau and DMSO三種天然滲透壓調(diào)節(jié)劑在人體內(nèi)含量豐富，脯氨酸和甘氨酸都是蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵原料，�；撬崾且环N人體內(nèi)大量存在的非蛋白β-氨基酸。它們不僅是調(diào)控細胞生化反應(yīng)和生理過程所必需的功能性氨基酸，而且還是人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)。它們在人體血漿、組織、器官中天然存在。脯氨酸和甘氨酸各占人體膠原蛋白（人體內(nèi)最豐富的蛋白）中氨基酸總量的30%。脯氨酸在血漿中的游離濃度為51-271μM，也是人體蛋白質(zhì)合成中需求量最高的氨基酸，在初生嬰兒體內(nèi)脯氨酸占有全身蛋白質(zhì)含量的8.3%（wt）[60, 61]。甘氨酸在血漿中的濃度為52-224 μM，對于70 kg的成年人來說，每天用于膠原蛋白合成的甘氨酸需求量為10 g，每天通過飲食攝取的甘氨酸可達1.5-3g[62, 63]。�；撬崾侨梭w細胞內(nèi)含量最豐富的游離氨基酸

床應(yīng)用的瓶頸問題。因此，在新型凍存保護劑的開發(fā)中，生物相容性是必須要考慮的因素。圖2-2 天然滲透壓調(diào)節(jié)劑（脯氨酸，甘氨酸，�；撬幔┖虳MSO對GLC-82細胞的細胞毒性。（A）活死染色熒光圖。綠色，活細胞；紅色，死細胞；比例尺=100 μm；（B）細胞存活率；（C）細胞貼壁形態(tài)。比例尺=100 μmFigure 2-2 Cytotoxicity of natural osmoprotectants (Pro, Gly, Tau) and DMSO to GLC-82 cells.(A) Fluorescence images of the live/dead assay. Green, live cells. Red, dead cells. Scale bar = 100μm. (B) Cell viability. (C) Attachment morphology. Scale bar = 100 μm脯氨酸、甘氨酸和�；撬岫际窃谧匀唤缰写罅慷鴱V泛存在的天然滲透壓調(diào)節(jié)劑[60, 88, 89]，在生物系統(tǒng)中通常具有良好的生物相容性。為了驗證它們對細胞的生

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本文編號：2831413