由創(chuàng)傷、感染、腫瘤等引起的口腔頜面部骨缺損,嚴(yán)重影響患者的身心健康。在納米材料促成骨作用的研究中,本課題組證明了多孔二氧化硅納米粒子負(fù)載BMP-2質(zhì)粒在體內(nèi)具有良好的促骨形成效果,表明該納米粒子具有較好的生物學(xué)活性,但是,其在細(xì)胞內(nèi)的命運(yùn)和所涉及機(jī)制還有待闡明。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),探究自噬在多孔二氧化硅納米粒子促進(jìn)小鼠顱骨來(lái)源前成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)成骨分化中的作用,為該納米粒子的促骨形成機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。首先,我們采用反相微乳液法合成聚乙烯亞胺修飾的多孔二氧化硅納米粒子(PEI modified porous silica nanoparticles,PPSNs)。掃描電鏡下及透射電鏡下觀察PPSNs呈樹枝狀,多孔,分散性良好,尺寸主要分布在110-230 nm,動(dòng)態(tài)光散射測(cè)得該粒子帶正電,理論上可以與帶負(fù)電的質(zhì)粒結(jié)合。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PPSNs對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)PPSNs會(huì)引起細(xì)胞凋亡,且呈濃度依賴性,但是達(dá)到較高濃度時(shí)細(xì)胞存活率仍在80%以上,提示材料生物相容性較好。ELISA實(shí)驗(yàn)中,利用PPSNs、BMP-2質(zhì)粒(簡(jiǎn)稱pBMP-2)、PPSNs負(fù)載BMP-2質(zhì)粒(簡(jiǎn)稱PPSNs/pBMP-2)轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞,未在pBMP-2組的上清液中檢測(cè)到BMP-2蛋白的表達(dá),考慮是質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后被溶酶體消化致無(wú)效轉(zhuǎn)染,因此將分組設(shè)為空白組、實(shí)驗(yàn)組(PPSNs組、PPSNs/pBMP-2組)。接著,我們進(jìn)行細(xì)胞自噬水平的檢測(cè),通過(guò)透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體,可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組中自噬體數(shù)量較空白組多;吖啶橙染色觀察細(xì)胞內(nèi)酸性囊泡,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組內(nèi)酸性囊泡增多;Western Blot觀察自噬相關(guān)蛋白水平的變化,顯示實(shí)驗(yàn)組內(nèi)LC3-I向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)換率上升,且PPSNs/pBMP-2組上升更加明顯,以上結(jié)果均提示PPSNs、PPSNs/pBMP-2具有促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞自噬的作用。最后,我們利用3-甲基腺嘌呤抑制細(xì)胞自噬并檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá),Real-Time PCR結(jié)果顯示自噬抑制劑處理組ALP和Col1表達(dá)較未用抑制劑處理組下降,但是與空白組相比,PPSNs/pBMP-2組內(nèi)ALP和Col1水平仍較高,說(shuō)明PPSNs刺激自噬和pBMP-2表達(dá)共同促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。綜上所述,PPSNs、PPSNs/pBMP-2能夠通過(guò)自噬促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R783.1
【部分圖文】：

細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率變化。逡逑２．２．３邋ＥＬＩＳＡ篩選實(shí)驗(yàn)分組逡逑通過(guò)ＥＬＩＳＡ實(shí)驗(yàn)確定實(shí)驗(yàn)分組。如圖２．３所示，與空白對(duì)照組相比，；逡逑轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞后無(wú)法在上清液中檢測(cè)到ＢＭＰ－２蛋白的表達(dá)，考慮其被溶酶體降解逡逑而導(dǎo)致無(wú)效轉(zhuǎn)染。而ＰＰＳＮｓ組及ＰＰＳＮｓ／／？５ＭＰ－２組均可以促進(jìn)細(xì)胞ＢＭＰ－２蛋白的逡逑表達(dá)，且ＰＰＳＮｓ／；＾ＭＰ－２組上清液內(nèi)ＢＭＰ－２蛋白濃度更高（Ｐ＜０．０１）。因此，我們逡逑將實(shí)驗(yàn)設(shè)為空白組，ＰＰＳＮｓ組和ＰＰＳＮｓ／／？５ＭＰ－２組。逡逑１３逡逑

邐ＰＰＳＮｓ邐ｐＢＭＰ－２邋ＰＰＳＮｓ／ｐＢＭＰ－２逡逑圖２．３邋ＰＰＳＮｓ，邋ｐＳ／ＷＰ－２和ＰＰＳＮｓ／ｐＳＭＰ－２處理細(xì)胞后ＢＭＰ－２蛋白的表達(dá)。逡逑ＰＰＳＮｓ，邋ｐＳＭＰ－２和ＰＰＳＮｓ／ｐＢＭＰ－２轉(zhuǎn)染細(xì)胞２４ｈ后，ＥＬＩＳＡ檢測(cè)上清液中ＢＭＰ－２逡逑蛋白的表達(dá)。（＊Ｐ＜0．0５；邋＊＊Ｐ＜０．０１．）逡逑２．２．４邋ＴＥＭ觀察材料的胞內(nèi)分布逡逑通過(guò)透射電鏡觀察材料進(jìn)入細(xì)胞后分布。如圖２．４所示，ＰＰＳＮｓ通過(guò)內(nèi)吞進(jìn)入逡逑細(xì)胞（紅色＊），部分ＰＰＳＮｓ或ＰＰＳＮｓ／ｔ＾ＭＰ－２邋（紅色＊）存在于細(xì)胞質(zhì)中。有趣的逡逑是，我們?cè)诮M發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)溶酶體明顯增多（黃色＊）。逡逑幽＿逡逑ＰＰＳＮｓ邐ＰＰＳＵ？ｌｐＢＭＰ－２逡逑ｍｍ逡逑圖２．４邋ＰＰＳＮｓ，／ｏＳ／ＷＰ－２和ＰＰＳＮｓ／ｐＳ／ＷＰ－２的胞內(nèi)分布。ＰＰＳＮｓ，邋ｐＢ／ＷＰ－２逡逑和ＰＰＳＮｓ／ｐＢ／ＷＰ－２轉(zhuǎn)染細(xì)胞２４ｈ后，ＴＥＭ觀察細(xì)胞內(nèi)材料的分布（紅色＊）及溶逡逑酶體的增多（黃色０。逡逑１４逡逑

蛋白的表達(dá)。（＊Ｐ＜0．0５；邋＊＊Ｐ＜０．０１．）逡逑２．２．４邋ＴＥＭ觀察材料的胞內(nèi)分布逡逑通過(guò)透射電鏡觀察材料進(jìn)入細(xì)胞后分布。如圖２．４所示，ＰＰＳＮｓ通過(guò)內(nèi)吞進(jìn)入逡逑細(xì)胞（紅色＊），部分ＰＰＳＮｓ或ＰＰＳＮｓ／ｔ＾ＭＰ－２邋（紅色＊）存在于細(xì)胞質(zhì)中。有趣的逡逑是，我們?cè)诮M發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)溶酶體明顯增多（黃色＊）。逡逑幽＿逡逑ＰＰＳＮｓ邐ＰＰＳＵ？ｌｐＢＭＰ－２逡逑ｍｍ逡逑圖２．４邋ＰＰＳＮｓ，／ｏＳ／ＷＰ－２和ＰＰＳＮｓ／ｐＳ／ＷＰ－２的胞內(nèi)分布。ＰＰＳＮｓ，邋ｐＢ／ＷＰ－２逡逑和ＰＰＳＮｓ／ｐＢ／ＷＰ－２轉(zhuǎn)染細(xì)胞２４ｈ后，ＴＥＭ觀察細(xì)胞內(nèi)材料的分布（紅色＊）及溶逡逑酶體的增多（黃色０。逡逑１４逡逑

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本文編號(hào)：2828024