發(fā)布時間：2020-09-27 14:59

　　 由創(chuàng)傷、感染、腫瘤等引起的口腔頜面部骨缺損,嚴重影響患者的身心健康。在納米材料促成骨作用的研究中,本課題組證明了多孔二氧化硅納米粒子負載BMP-2質(zhì)粒在體內(nèi)具有良好的促骨形成效果,表明該納米粒子具有較好的生物學活性,但是,其在細胞內(nèi)的命運和所涉及機制還有待闡明。本研究通過體外實驗,探究自噬在多孔二氧化硅納米粒子促進小鼠顱骨來源前成骨細胞(MC3T3-E1)成骨分化中的作用,為該納米粒子的促骨形成機制的研究提供實驗基礎(chǔ)。首先,我們采用反相微乳液法合成聚乙烯亞胺修飾的多孔二氧化硅納米粒子(PEI modified porous silica nanoparticles,PPSNs)。掃描電鏡下及透射電鏡下觀察PPSNs呈樹枝狀,多孔,分散性良好,尺寸主要分布在110-230 nm,動態(tài)光散射測得該粒子帶正電,理論上可以與帶負電的質(zhì)粒結(jié)合。流式細胞術(shù)檢測PPSNs對MC3T3-E1細胞凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)PPSNs會引起細胞凋亡,且呈濃度依賴性,但是達到較高濃度時細胞存活率仍在80%以上,提示材料生物相容性較好。ELISA實驗中,利用PPSNs、BMP-2質(zhì)粒(簡稱pBMP-2)、PPSNs負載BMP-2質(zhì)粒(簡稱PPSNs/pBMP-2)轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細胞,未在pBMP-2組的上清液中檢測到BMP-2蛋白的表達,考慮是質(zhì)粒進入細胞后被溶酶體消化致無效轉(zhuǎn)染,因此將分組設(shè)為空白組、實驗組(PPSNs組、PPSNs/pBMP-2組)。接著,我們進行細胞自噬水平的檢測,通過透射電鏡觀察細胞內(nèi)自噬體,可見實驗組中自噬體數(shù)量較空白組多;吖啶橙染色觀察細胞內(nèi)酸性囊泡,發(fā)現(xiàn)實驗組內(nèi)酸性囊泡增多;Western Blot觀察自噬相關(guān)蛋白水平的變化,顯示實驗組內(nèi)LC3-I向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)換率上升,且PPSNs/pBMP-2組上升更加明顯,以上結(jié)果均提示PPSNs、PPSNs/pBMP-2具有促進MC3T3-E1細胞自噬的作用。最后,我們利用3-甲基腺嘌呤抑制細胞自噬并檢測成骨相關(guān)基因的表達,Real-Time PCR結(jié)果顯示自噬抑制劑處理組ALP和Col1表達較未用抑制劑處理組下降,但是與空白組相比,PPSNs/pBMP-2組內(nèi)ALP和Col1水平仍較高,說明PPSNs刺激自噬和pBMP-2表達共同促進成骨細胞分化。綜上所述,PPSNs、PPSNs/pBMP-2能夠通過自噬促進MC3T3-E1細胞成骨分化。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R783.1
【部分圖文】：

細胞術(shù)檢測細胞凋亡率變化。逡逑２．２．３邋ＥＬＩＳＡ篩選實驗分組逡逑通過ＥＬＩＳＡ實驗確定實驗分組。如圖２．３所示，與空白對照組相比，；逡逑轉(zhuǎn)染進入細胞后無法在上清液中檢測到ＢＭＰ－２蛋白的表達，考慮其被溶酶體降解逡逑而導致無效轉(zhuǎn)染。而ＰＰＳＮｓ組及ＰＰＳＮｓ／／？５ＭＰ－２組均可以促進細胞ＢＭＰ－２蛋白的逡逑表達，且ＰＰＳＮｓ／；＾ＭＰ－２組上清液內(nèi)ＢＭＰ－２蛋白濃度更高（Ｐ＜０．０１）。因此，我們逡逑將實驗設(shè)為空白組，ＰＰＳＮｓ組和ＰＰＳＮｓ／／？５ＭＰ－２組。逡逑１３逡逑

邐ＰＰＳＮｓ邐ｐＢＭＰ－２邋ＰＰＳＮｓ／ｐＢＭＰ－２逡逑圖２．３邋ＰＰＳＮｓ，邋ｐＳ／ＷＰ－２和ＰＰＳＮｓ／ｐＳＭＰ－２處理細胞后ＢＭＰ－２蛋白的表達。逡逑ＰＰＳＮｓ，邋ｐＳＭＰ－２和ＰＰＳＮｓ／ｐＢＭＰ－２轉(zhuǎn)染細胞２４ｈ后，ＥＬＩＳＡ檢測上清液中ＢＭＰ－２逡逑蛋白的表達。（＊Ｐ＜0．0５；邋＊＊Ｐ＜０．０１．）逡逑２．２．４邋ＴＥＭ觀察材料的胞內(nèi)分布逡逑通過透射電鏡觀察材料進入細胞后分布。如圖２．４所示，ＰＰＳＮｓ通過內(nèi)吞進入逡逑細胞（紅色＊），部分ＰＰＳＮｓ或ＰＰＳＮｓ／ｔ＾ＭＰ－２邋（紅色＊）存在于細胞質(zhì)中。有趣的逡逑是，我們在組發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)內(nèi)溶酶體明顯增多（黃色＊）。逡逑幽＿逡逑ＰＰＳＮｓ邐ＰＰＳＵ？ｌｐＢＭＰ－２逡逑ｍｍ逡逑圖２．４邋ＰＰＳＮｓ，／ｏＳ／ＷＰ－２和ＰＰＳＮｓ／ｐＳ／ＷＰ－２的胞內(nèi)分布。ＰＰＳＮｓ，邋ｐＢ／ＷＰ－２逡逑和ＰＰＳＮｓ／ｐＢ／ＷＰ－２轉(zhuǎn)染細胞２４ｈ后，ＴＥＭ觀察細胞內(nèi)材料的分布（紅色＊）及溶逡逑酶體的增多（黃色０。逡逑１４逡逑

蛋白的表達。（＊Ｐ＜0．0５；邋＊＊Ｐ＜０．０１．）逡逑２．２．４邋ＴＥＭ觀察材料的胞內(nèi)分布逡逑通過透射電鏡觀察材料進入細胞后分布。如圖２．４所示，ＰＰＳＮｓ通過內(nèi)吞進入逡逑細胞（紅色＊），部分ＰＰＳＮｓ或ＰＰＳＮｓ／ｔ＾ＭＰ－２邋（紅色＊）存在于細胞質(zhì)中。有趣的逡逑是，我們在組發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)內(nèi)溶酶體明顯增多（黃色＊）。逡逑幽＿逡逑ＰＰＳＮｓ邐ＰＰＳＵ？ｌｐＢＭＰ－２逡逑ｍｍ逡逑圖２．４邋ＰＰＳＮｓ，／ｏＳ／ＷＰ－２和ＰＰＳＮｓ／ｐＳ／ＷＰ－２的胞內(nèi)分布。ＰＰＳＮｓ，邋ｐＢ／ＷＰ－２逡逑和ＰＰＳＮｓ／ｐＢ／ＷＰ－２轉(zhuǎn)染細胞２４ｈ后，ＴＥＭ觀察細胞內(nèi)材料的分布（紅色＊）及溶逡逑酶體的增多（黃色０。逡逑１４逡逑

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本文編號：2828024