[目的]以前期課題組成員表征的骨界面微觀形貌為指導(dǎo),通過(guò)靜電紡絲(electrostatic spinning,ES)技術(shù),仿生制備具有近似骨界面微觀形貌的聚乳酸(Polylactic Acid,PLA)纖維膜并觀察其對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rat bone mesenchymal stem cells,rBMSCs)增殖、黏附、鋪展、成骨分化的影響,探討仿生的微觀形貌是否能促進(jìn)rBMSCs成骨分化,旨在獲得微觀形貌高度模擬天然骨界面,骨誘導(dǎo)能力和生物相容性良好的骨損傷修復(fù)支架材料。[方法]1、仿生聚乳酸纖維膜的制備、表征、參數(shù)測(cè)量將聚乳酸、氯仿以不同比例混合溶解均勻,通過(guò)該調(diào)節(jié)電紡參數(shù):電壓、接受距離、接收時(shí)間,制備微觀形貌不同的聚乳酸纖維膜。利用低真空環(huán)境掃描電鏡對(duì)經(jīng)梯度脫水臨界點(diǎn)干燥后的纖維膜樣品進(jìn)行高分辨成像并隨機(jī)選取15樣本進(jìn)行纖維直徑測(cè)量;采用壓汞法測(cè)定支架孔隙率。以課題組成員前期利用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)表征、獲得骨界面的部分形貌參數(shù)(膠原纖維直徑)為指導(dǎo),篩選出微觀形貌仿生的聚乳酸纖維膜。2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、鑒定 使用全骨髓貼壁法分離純化SD大鼠BMSCs,進(jìn)行體外擴(kuò)增、傳代培養(yǎng)。分別通過(guò)免疫熒光技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù),利用小鼠抗大鼠單克隆抗體FITC-anti-Mouse/Rat CD 44、PE--anti-Mouse/Rat CD45、APC--anti-Mouse/Rat CD90,標(biāo)記并鑒定 SD 大鼠P2代BMSCs表面分子標(biāo)志,驗(yàn)證獲得細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,為后續(xù)細(xì)胞與聚乳酸纖維膜共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)提胞保證。3、不同形貌聚乳酸纖維膜上的細(xì)胞行為及成骨分化檢測(cè)選擇適宜的P2-P4代rBMSCs細(xì)胞,分別在A組(直徑357±32nm),B組(直徑164±13nm)、C組(直徑1311±93nm)、Ctrl組(無(wú)形貌空白對(duì)照)上接種培養(yǎng)。掃面電鏡(SEM)觀察rBMSCs在聚乳酸纖維膜上的生長(zhǎng)、鋪展、融合情況;蘇木紫染色觀察rBMSCs在聚乳酸纖維膜上的存活情況;CCK-8試劑盒檢測(cè)rBMSCs在聚乳酸纖維膜上的增殖、黏附情況;qRT-PCR檢測(cè)Runx2(runt-related transcription factor 2,Runx2)、Ⅰ 型膠原(collagen type Ⅰ,COLI)、堿性磷酸酶(alkalinephosphatase, ALP)、鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子(Osterix,Osx ) mRNA的表達(dá);WB檢測(cè)骨橋蛋白(Osteopontin, OPN)、骨鈣素(osteocalcin, OCN)的表達(dá)。觀察聚乳酸纖維膜生物相容性及不同形貌纖維膜對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、黏附、成骨分化的影響。[結(jié)果]1、通過(guò)改變聚乳酸濃度(4%-5%);靜電紡絲參數(shù)電壓(18kv-22kv);接收距離(12cm-15cm);接收時(shí)間(1h-2h)得到了纖維直徑60nm-1300nm,不同形貌的聚乳酸纖維膜。分別以電紡參數(shù)(4.5%, 22kv,15cm,1h), (4.5%,22kv,15cm,2h),(5%,22kv, 15cm,1h),(5%,22kv, 15cm, 1h)制備的直徑分別為164±13nm,182±37nm, 326±27nm,357±32nm纖維膜,纖維粗細(xì)均勻,形成類似于細(xì)胞外基質(zhì)中膠原纖維形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),可認(rèn)為是形貌仿生纖維膜,其中直徑198-365nm(326±27nm,357±32nm)的纖維膜更接近仿生。2、P1代的BMSCs培養(yǎng)培養(yǎng)24h后,部分細(xì)胞貼壁,細(xì)胞呈多角形,少量成類橢圓短梭型外觀,見(jiàn)細(xì)胞少數(shù)集落,培養(yǎng)48h后細(xì)胞集落增大增多,總體細(xì)胞密度較前呈倍數(shù)增長(zhǎng),培養(yǎng)72h后細(xì)胞呈現(xiàn)典型的紡錘體樣外觀,較多的貼壁細(xì)胞相互靠近融合,放射狀或旋渦狀。培養(yǎng)第5天后的細(xì)胞集落彼此靠近并融合連成片。原代培養(yǎng)的rBMSCs于5-7d達(dá)80～90%融合可傳代,rBMSCs傳代后(1:3傳代)3天左右能到達(dá)80～90%融合,可再次傳代,傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)良好。熒光免疫檢測(cè)顯示P2代BMSCs的CD90、CD44呈陽(yáng)性表達(dá),CD45為陰性熒光著色,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示P2代BMSCs的CD45-PE、CD44-FITC、CD90-APC表達(dá)率分別為1.65%、94.1%和95.8%,符合間充質(zhì)干細(xì)胞的典型生物學(xué)特征。3、蘇木紫染色顯示:細(xì)胞在聚乳酸纖維膜上生長(zhǎng)良好;SEM顯示:細(xì)胞爬附于三種聚乳酸纖維膜表面生長(zhǎng)良好,十多個(gè)至數(shù)十個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)集落,細(xì)胞與細(xì)胞之間聯(lián)系緊密,A組(直徑357±32nm) , B組(直徑164±13nm )纖維膜上細(xì)胞具有明顯聚集區(qū)域,細(xì)胞向四周散發(fā)式生長(zhǎng),細(xì)胞伸出突起相互連接,集落鋪展較C組(直徑1311±93nm)及普通培養(yǎng)板組充分,數(shù)量較多,尺寸較大。典型細(xì)胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)A組(直徑357±32nm),B組(直徑164±13nm )較C組(直徑1311±93nm)及普通培養(yǎng)板組,細(xì)胞鋪展面積更大、細(xì)胞偽足更多,且細(xì)胞嵌入纖維膜表面,偽足和纖維黏合緊密在A組(直徑357±32nm)最為明顯;CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)顯示,第1、3、5天,普通培養(yǎng)板對(duì)照組、A組(直徑357±32nm)、B組(直徑164±13nm )增值均優(yōu)于C組(直徑1311±93nm),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),三組間對(duì)比,普通培養(yǎng)板對(duì)照組優(yōu)于A組、B組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05) , A組、B組二組間對(duì)比,A組高于B組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在第7、9天,普通培養(yǎng)板對(duì)照組、A組(直徑357±32nm)、B組(直徑164±13nm )增值均優(yōu)于C組(直徑1311±93nm),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),三組間對(duì)比,普通培養(yǎng)板對(duì)照組優(yōu)于A組、B組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),A、B二組間對(duì)比,A組優(yōu)于B組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);黏附實(shí)驗(yàn)顯示:在4h,普通培養(yǎng)板對(duì)照組優(yōu)于C組(直徑1311±93nm)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其余各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),在 8h 和 16h,A 組(直徑 357±32nm)、B 組(直徑 164±13nm )、C (直徑1311±93nm)三組不如普通培養(yǎng)板對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05) , A、B、C三組間對(duì)比A、B組均高于C組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),A、B二組間對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);成骨分化檢測(cè)顯示:A組(直徑 357±32nm),ALP、COLI、Runx2、OSXmRNA 表達(dá)量均明顯高于 B 組(直徑164±13nm )、C組(直徑1311±93nm)及普通培養(yǎng)板對(duì)照組,低于陽(yáng)性對(duì)照組;B組(直徑164±13nm )、C組(直徑1311±93nm)及普通培養(yǎng)板對(duì)照組,低于陽(yáng)性對(duì)照組。[結(jié)論]1.分別以電紡參數(shù)(4.5%,22kv,15cm,1h),(4.5%,22kv,15cm,2h),(5%,22kv,15cm,1h),(5%, 22kv,15cm,1h)制備的直徑分別為 164±13nm,182±37nm,326±27nm,357±32nm纖維膜,纖維粗細(xì)均勻,形成類似于細(xì)胞外基質(zhì)中膠原纖維形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),可認(rèn)為是形貌仿生纖維膜,其中直徑為326±27nm,357±32nm的纖維膜更接近仿生2.纖維膜形貌影響rBMSCs鋪展形態(tài)、面積,直徑357±32nm的纖維膜上,細(xì)胞明顯區(qū)域聚集、向四周散發(fā)式生長(zhǎng)、鋪展面積更大、細(xì)胞偽足更多。3.直徑為357±32n和164±13nm纖維膜與直徑為1311±93nm纖維膜相比,能促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖。4.纖維膜微觀形貌影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化,仿生制備的直徑為357±32nm的纖維膜具有明顯的成骨誘導(dǎo)能力。
【學(xué)位單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R318.08;R68
【部分圖文】：

其原理是聚合物溶液或熔體在強(qiáng)電場(chǎng)中進(jìn)行噴射紡絲。在電場(chǎng)作用下，針頭處的逡逑液滴會(huì)由球形變?yōu)閳A錐形（即＂泰勒錐＂），并從圓錐尖端延展得到纖維細(xì)絲，這種逡逑方式可以生產(chǎn)出納米級(jí)直徑的聚合物細(xì)絲（圖２）。１９３４年，Ｆｏｒｍａｌａｓ發(fā)明了用逡逑靜電力制備聚合物纖維的實(shí)驗(yàn)裝置標(biāo)志著靜電紡絲技術(shù)制備纖維的開端。近年逡逑來(lái)，采用靜電紡技術(shù)制備的聚合物納米纖維己經(jīng)廣泛應(yīng)用在皮膚、血管、軟骨、逡逑骨、神經(jīng)等組織工程研究領(lǐng)域。通過(guò)調(diào)節(jié)其工藝參數(shù)制備出的三維多孔納米纖維逡逑膜具有纖維直徑與組織基質(zhì)中的膠原蛋白尺寸相近、表面積大，孔隙率高類似于逡逑天然細(xì)胞外基質(zhì)的纖維膜［２｜’２２］，在在醫(yī)學(xué)組織工程領(lǐng)域廣闊的應(yīng)用前景［２３’２４］。逡逑影響靜電紡絲的因素主要有：聚合物的分子量分子結(jié)構(gòu)等；溶液性質(zhì)；接收逡逑電壓大小；接收距離；環(huán)境參數(shù)（溫度，濕度等）；收集裝置；噴絲口針頭形狀。逡逑其中溶液組成、電壓、接收距離、接收裝置是主要的影響因素，通過(guò)調(diào)節(jié)以上參逡逑數(shù)，可制備出成膜面積大，直徑從納米到微米可調(diào)，孔隙率高、纖維連續(xù)性好、逡逑堆積密度可控的纖維膜。結(jié)合課題組成員前期利用掃描電子顯微鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇ逡逑ｅｌｅｃｔｒｏｎ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，邋ＳＥＭ）表征、獲得骨界面的形貌參數(shù)，選擇微觀形貌合適聚乳逡逑酸纖維膜

２．將紡絲液注入紡絲裝置中的注射器內(nèi)（１９號(hào)針頭，直徑１．４ｍｍ），流速逡逑設(shè)置為１．５ｍＬ／ｈ，調(diào)節(jié)接收距離（１２－１５ｃｍ），電壓（１８－２２ｋｖ），接受時(shí)間（ｌ－２ｈ）逡逑制備聚乳酸纖維膜（圖３，邋４），將纖維膜真空千燥，裁剪，收集備用。逡逑ｌｉｅＳＶＭＢ逡逑圖３：靜電紡絲機(jī)邐圖４：靜電紡絲機(jī)工作逡逑Ｆｉｇ．邋３邋Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ邋ｓｐｉｎｎｉｎｇ邋ｍａｃｈｉｎｅ邐Ｆｉｇ．４邋Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ邋ｍａｃｈｉｎｅ邋ｗｏｒｋ逡逑１７逡逑

，２；逡逑２．用導(dǎo)電膠布將纖維膜粘于導(dǎo)電基臺(tái)上（圖５），抽真空后對(duì)纖維膜噴金逡逑處理，噴金電流為４５邋ｍＡ，過(guò)程為３０邋ｓ，連續(xù)噴金２次；逡逑３．加速電壓２０邋ｋＶ行掃描電鏡，不同倍數(shù)放大，選擇合適圖片拍照（圖６）。逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉洋;韓東;華聞達(dá);何飛;;基底硬度與形貌協(xié)同對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響[J];醫(yī)用生物力學(xué);2016年03期

2 華聞達(dá);韓東;吳迪;馮建濤;許明卿;何飛;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)不同時(shí)長(zhǎng)應(yīng)力刺激的力學(xué)響應(yīng)[J];醫(yī)用生物力學(xué);2015年01期

3 方海林;李軍孝;姚林明;趙濤;;松果菊苷通過(guò)激活ERK/BMP-2信號(hào)通路促進(jìn)大鼠的成骨細(xì)胞增殖觀察[J];基層醫(yī)學(xué)論壇;2015年04期

4 楊琦;索進(jìn)平;;氣體發(fā)泡法制備PLLA/BCP多孔復(fù)合支架及其性能研究[J];化學(xué)與生物工程;2014年05期

5 Jan Henkel;Maria A.Woodruff;Devakara R.Epari;Roland Steck;Vaida Glatt;Ian C.Dickinson;Peter F.M.Choong;Michael A.Schuetz;Dietmar W.Hutmacher;;Bone Regeneration Based on Tissue Engineering Conceptions  A 21st Century Perspective[J];Bone Research;2013年03期

6 張志宏;劉志禮;高志增;陳明;楊東;黃山虎;舒勇;;骨修復(fù)替代材料修復(fù)骨缺損的選擇與應(yīng)用[J];中國(guó)組織工程研究;2012年52期

7 李燁;劉文鋒;劉如石;印大中;;丙二醛通過(guò)激活p38和JNK通路抑制間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2012年09期

8 劉偉;劉萌;祝勁松;郝紅偉;董寧征;周海斌;;人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)、鑒定及成骨分化[J];中國(guó)組織工程研究;2012年14期

9 李靜;馮建濤;孫全梅;韓東;;血管功能界面微納尺度形貌的表征與仿生制備[J];微循環(huán)學(xué)雜志;2011年02期

10 孔維霞;朱恒;江小霞;李紅;劉元林;吳英;張毅;毛寧;;MAPK通路參與小鼠骨實(shí)質(zhì)來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨的分化[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2010年04期

本文編號(hào)：2827130