肌肉移植是有效修復(fù)大面積肌肉缺損的手段,但由于可利用的肌肉來源有限,供區(qū)損傷較大,以及異體移植供體來源和免疫排斥等問題,使其應(yīng)用受到限制。隨著組織工程的發(fā)展,尤其是骨骼肌組織工程在肌肉組織再生和功能重建方面的進(jìn)展,為解決骨骼肌組織缺損和功能喪失等問題帶來了希望。本文構(gòu)建了一種帶血管網(wǎng)酶交聯(lián)水凝膠與EVOH電紡基底膜疊加組裝的復(fù)合肌組織工程支架,通過體外灌流-拉伸動態(tài)培養(yǎng),實現(xiàn)了肌細(xì)胞定向排列和向肌小管體外分化的過程,為仿生血管網(wǎng)的參數(shù)優(yōu)化提供理論參考和實驗依據(jù)。本文主要工作及成果如下:首先,以仿生設(shè)計思路為指導(dǎo),通過分形模型的理論計算,提出了一種多級多尺寸的仿生血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)。通過分布函數(shù)計算出該血管網(wǎng)的分形維數(shù)為2.99,證明設(shè)計模型符合體內(nèi)微小血管的功能要求,形成結(jié)構(gòu)與功能相適應(yīng)的生物學(xué)概念。通過CFD流體分析,將血管網(wǎng)模型與DAVID體外模型灌流的壓力-流速曲線進(jìn)行對比,結(jié)果表明流速誤差小于5%,證實流體分析方法的有效性。其次,研究仿生血管網(wǎng)的微制造工藝,通過SLA光固化成型法和翻模制造方法,制備TG酶交聯(lián)水凝膠作為基質(zhì)材料的仿生血管網(wǎng)。研究制造仿生血管網(wǎng)的成型精度、降解速度和生物相容性等性能,結(jié)果證明基質(zhì)材料成型精度高,可以長時間維持微流道結(jié)構(gòu),在流體和重力等因素作用下,微流道截面形狀逐漸由矩形轉(zhuǎn)變成更接近體內(nèi)實際結(jié)構(gòu)的圓形,且細(xì)胞毒性低,生物相容性好。通過CFD流體分析,確定1ml/min的流速作為體外培養(yǎng)的灌流參數(shù)。第三,通過多細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù),研究了酶交聯(lián)水凝膠材料的生物相容性,證實肌細(xì)胞,內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)時,可以在基質(zhì)材料內(nèi)呈現(xiàn)良好的增殖趨勢。在仿生血管網(wǎng)內(nèi)種植HUVEC-GFP細(xì)胞,灌流培養(yǎng)后,通過對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)和增值動力學(xué)檢測,研究了血管網(wǎng)參數(shù)對內(nèi)皮化的影響。結(jié)果證明,500μm內(nèi)的仿生血管網(wǎng)中,血管直徑越小對形成內(nèi)皮化越為有利,而分叉角則對細(xì)胞的生長和代謝影響不大。第四,根據(jù)體內(nèi)肌肉結(jié)構(gòu),設(shè)計了血管網(wǎng)-基質(zhì)-筋膜層的疊加式復(fù)合肌組織工程支架。通過電紡技術(shù)制備EVOH納米纖維膜,模擬體內(nèi)筋膜層,并與帶血管網(wǎng)水凝膠組裝構(gòu)建復(fù)合支架。研究了納米纖維筋膜層的制備工藝參數(shù)和支架組裝工藝,疊加式支架的灌流和力學(xué)性能,為體外動態(tài)培養(yǎng)提供了可拉伸的肌組織工程支架模型。同時還研究了筋膜層基底膜的生物相容性和抑菌作用等生物性能,證實該支架具有良好的生物相容性,同時具有廣譜抗菌作用,為多因素體外動態(tài)培養(yǎng)提供了有利條件。第五,設(shè)計帶密封腔室的生物反應(yīng)器,搭建了體外灌流-拉伸動態(tài)培養(yǎng)平臺。該平臺提供了一種密封腔室的力學(xué)拉伸試驗系統(tǒng),并且準(zhǔn)確控制軟組織的拉伸量。此外,該系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)分別對腔室和血管網(wǎng)進(jìn)行灌流,模擬體內(nèi)血液的流動和營養(yǎng)供給,為細(xì)胞的增殖,延長和分化提供研究基礎(chǔ)。第六,在體外灌流-拉伸動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)上,對帶血管網(wǎng)的肌組織工程支架進(jìn)行體外動態(tài)培養(yǎng)。提出了一種肌組織工程體外動態(tài)培養(yǎng)評價方法,研究了血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)參數(shù)對肌細(xì)胞定向排列和分化的影響。結(jié)果證明仿生血管網(wǎng)能有效促進(jìn)肌細(xì)胞實現(xiàn)定向排列和分化,并且證實了本文仿生血管網(wǎng)內(nèi)培養(yǎng)液的滲透距離大約為300μm。
【學(xué)位單位】：西安科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R318.08
【部分圖文】：

西安科技大學(xué)博士學(xué)位論文2圖1.1 肌肉組織工程[7]1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1 肌組織工程支架制備方法的研究現(xiàn)狀近年來，3D 打印技術(shù)廣泛應(yīng)用在肌組織工程的研究領(lǐng)域，該方法可成型復(fù)雜功能型支架/細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）[20]。目前主要使用的方法有以下三種，選擇性激光燒結(jié)(SLS)，光固化成型(SLA)，以及熔合沉積法(FDM)和壓力擠出成型（PBE），如圖 1.2 所示[21]。(a)SLS 打印法 (b)SLA 打印法 (c) FDM 和 PBE 打印法圖1.2 肌肉組織工程3D打印方法示意圖[21]新加坡南洋理工大學(xué) Yeong 等人使用 SLS 成型方法，燒結(jié)出 PCL 聚合物的多孔肌肉支架

(a)SLS 打印法 (b)SLA 打印法 (c) FDM 和 PBE 打印法圖1.2 肌肉組織工程3D打印方法示意圖[21]新加坡南洋理工大學(xué) Yeong 等人使用 SLS 成型方法，燒結(jié)出 PCL 聚合物的多孔肌肉支架，封裝 C2C12 成肌細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后形成大面積肌小管，證明該方法成型的結(jié)構(gòu)，可保證培養(yǎng)液充分浸入，為內(nèi)部細(xì)胞提供充足的氧氣和營養(yǎng)[22]。如圖 1.3 所示。(a)CAD 模型 (b)SEM 圖像 (c)培養(yǎng) 6d 的 C2C12 分化為肌小管圖1.3 SLS法打印骨骼肌支架[22]支架單元構(gòu)建細(xì)胞片層細(xì)胞培養(yǎng)肌肉組織的產(chǎn)生細(xì)胞提取 體內(nèi)種植構(gòu)建定向排列肌小管構(gòu)建肌纖維復(fù)合支架4mm 100μm 100μm100μm

圖1.4 SLA法翻模制備PEG水凝膠支架[23]技大學(xué) Pati 等人將小鼠肌細(xì)胞 C2C12 封裝到生物墨水中，多孔脫細(xì)胞支架，培養(yǎng) 4d 后檢測到心臟特異性基因(Myh6數(shù)量不斷增加直到 14d[24]，如圖 1.5 所示。

【參考文獻(xiàn)】

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1 盧伶俐;陳學(xué)明;聶晚頻;李晨宇;李量大;馮海;姚凱;;生長激素對人工血管內(nèi)皮化的影響[J];中華實驗外科雜志;2015年10期

2 謝s

本文編號：2818795