研究背景全踝關(guān)節(jié)置換術(shù)(TAR)是治療終末期踝關(guān)節(jié)炎的有效手段,TAR具有保留踝關(guān)節(jié)運動功能,緩解疼痛、降低感染率及避免出現(xiàn)繼發(fā)性臨近關(guān)節(jié)退變等突出優(yōu)勢。目前全踝關(guān)節(jié)假體的研究主要存在如下困境:現(xiàn)有全踝關(guān)節(jié)假體的設(shè)計,尤其是距骨組件的設(shè)計仍不能滿足個體踝關(guān)節(jié)復(fù)雜的生物力學(xué)和運動學(xué)要求;現(xiàn)有假體的結(jié)構(gòu)材料和界面材料不統(tǒng)一,假體-骨界面的骨整合困難,假體感染、松動、下沉等并發(fā)癥仍較常見;在新型全踝關(guān)節(jié)假體的研制中,如何將實體的假體模型和多孔化的骨連接面有機地結(jié)合,快速設(shè)計和制造具有骨連接面多孔化的個體化假體組件有待研究。基于上述問題,本課題旨在利用三維數(shù)字化重建技術(shù),建立負重位狀態(tài)下踝-全足的三維模型,設(shè)計和分析假體模型,簡化假體的骨連接面結(jié)構(gòu)為多孔支架模型,分析新型含銅抗菌Co-Cr合金多孔支架的骨整合機制,規(guī)范假體模型和多孔化的骨連接面間適配設(shè)計流程,利用生物醫(yī)用3D打印技術(shù),快速制造個體化全踝關(guān)節(jié)假體距骨組件樣件,為新型假體的問世和臨床應(yīng)用提供理論和實踐基礎(chǔ)。材料和方法1.負重位踝關(guān)節(jié)-全足數(shù)字化三維建模(1)一名志愿者行足踝部負重位PedCAT錐形束CT(CBCT)掃描,測量掃描時間和成像時間,掃描數(shù)據(jù)以醫(yī)學(xué)數(shù)字成像通信標準(DICOM)格式導(dǎo)出。(2)Mimics軟件中閾值選擇、區(qū)域增長、圖像分割,建立踝關(guān)節(jié)-全足的骨性三維模型,在軟件中單獨提取距骨模型。(3)Geomagic軟件對模型進行網(wǎng)格檢查、糾錯和平滑處理,形成曲面化的計算機輔助設(shè)計(CAD)三維模型,生成封裝文件以初始圖形交換規(guī)范(IGES)格式輸出。2.個體化全踝關(guān)節(jié)假體距骨組件模型設(shè)計及有限元分析(1)參考現(xiàn)有全踝關(guān)節(jié)假體的參數(shù)和設(shè)計理念,設(shè)計距骨組件的滑車關(guān)節(jié)面和幾何固定裝置。(2)根據(jù)全踝關(guān)節(jié)假體距骨組件在矢狀面上的弧形截骨或角狀截骨方式,以及是否行外側(cè)面截骨,設(shè)計不同截骨方式的個體化距骨組件模型;設(shè)計假體為截骨面全覆蓋型,計算各種模型的截骨量和截骨面積。(3)對各種個體化距骨組件模型進行三維有限元分析,選擇雙足站立時的接觸力作為輸入載荷,計算假體和截骨后距骨的應(yīng)力分布,分析假體的靜態(tài)穩(wěn)定性。3.觀察新型含銅抗菌Co-Cr合金多孔支架對細胞生物學(xué)行為的影響(1)計算機輔助設(shè)計三維支架模型,用新型含銅抗菌Co-Cr合金粉末,激光選區(qū)熔化(SLM)技術(shù)制備多孔圓柱形支架,其直徑為10mm、總高為3.5mm,底層為實心、高度為0.5mm,多孔層為金剛石正8面體結(jié)構(gòu)、高度為3mm。(2)根據(jù)支架的孔隙率進行實驗分組,分為40%、60%和80%孔隙率三組,對應(yīng)的孔徑為201μm、373μm和454μm。(3)壓縮實驗檢測三組支架的力學(xué)性能,掃描電鏡觀察三組支架的多孔結(jié)構(gòu)表面特征,制備浸提液檢測材料的毒性。(4)清洗和滅菌多孔支架后,將L929細胞種植在三組支架上,高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)2天、4天和8天,進行相關(guān)生物學(xué)檢測。(5)全骨髓法分離及培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs),將BMSCs種植在三組支架上,成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)2天、4天和8天,進行相關(guān)生物學(xué)檢測。4.研究新型含銅抗菌Co-Cr合金多孔支架促進骨整合的機制(1)設(shè)計并制備60%孔隙率、孔徑為373μm的Co-Cr合金多孔圓柱支架,其直徑為5mm、總高為5.1mm,底層為鏤空結(jié)構(gòu)、高度為0.1mm,多孔層也為金剛石正8面體結(jié)構(gòu)、高度為5mm。(2)根據(jù)Co-Cr合金成分進行實驗分組:不含銅組及含銅組。(3)壓縮實驗檢測兩組支架的力學(xué)性能,掃描電鏡觀察兩組支架的多孔結(jié)構(gòu)表面特征。(4)清洗和滅菌多孔支架后,將BMSCs種植在兩組支架上,成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)2天、4天和8天,進行相關(guān)生物學(xué)檢測。(5)清洗和滅菌多孔支架后,對9頭山羊進行右側(cè)股骨遠端兩種多孔支架交叉植入術(shù)。術(shù)前和術(shù)后1天、30天、45天、60天采取山羊頸內(nèi)靜脈靜脈血,火焰原子吸收法測定山羊血清銅離子濃度。術(shù)后90天時處死所有山羊,即刻行右膝關(guān)節(jié)正側(cè)位X線攝片。取出含多孔支架的山羊股骨標本,行Micro-ct檢查,將數(shù)據(jù)導(dǎo)入DataViewer軟件中分析,用支架周圍骨組織容積灰度值來推測兩組支架周圍骨密度(BMD)差異。含支架的山羊股骨標本經(jīng)過固定、修塊、脫水、光聚合樹脂包埋、EXAKT硬組織切片機粘片、切片和磨片,制作兩張連續(xù)的硬組織切片,并將切片對應(yīng)標本和位置進行編號,以便進行切片分析時對應(yīng)同一個標本的相鄰植入位置。將上述每個支架獲得的2張硬組織切片中,選取1張在拉曼光譜儀下光譜指認,選擇掃描區(qū)域掃描,并結(jié)合和環(huán)境掃描電鏡掃描,綜合分析兩組多孔支架-骨界面的組織成分差異。上述每個支架獲得2張硬組織切片的另一張切片行亞甲基藍-酸性品紅染色,而完成了拉曼光譜和電鏡掃描的切片繼續(xù)行Goldner三色染色;所有染色切片在Olympus數(shù)字切片工作站放大20倍后數(shù)字化儲存。軟件打開數(shù)字化切片,計算兩組多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)部和周圍的成骨面積,對比分析兩組間的差異。5.制造個體化全踝關(guān)節(jié)假體距骨組件樣件(1)對COA+LO截骨方式的距骨組件模型進行骨連接面多孔化的適配設(shè)計,打印模型以STL格式導(dǎo)出。(2)打印模型導(dǎo)入SLM打印機,設(shè)置的45°傾斜支撐,制造個體化新型含銅抗菌Co-Cr合金距骨組件。(3)假體去支撐、拋光、清洗后,大體觀察和金相顯微鏡下觀察假體的外形、滑車關(guān)節(jié)面和多孔化的骨連接面。6.統(tǒng)計方法結(jié)果以平均值、標準差表示,使用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行單因素方差分析或者T檢驗分析,定義P0.05時結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.雙側(cè)足踝部CBCT負重位掃描時間為20秒,成像時間為3分鐘。負重位足踝部骨性三維模型全面的復(fù)現(xiàn)了雙足站立時踝關(guān)節(jié)-全足骨性空間位置和結(jié)構(gòu),并提取了距骨的骨性三維模型。2.設(shè)計了空心圓柱固定莖、2枚銷釘?shù)墓潭ㄑb置,以及完全個體化、解剖化滑車關(guān)節(jié)面的距骨組件。設(shè)計了四種不同截骨方式的距骨組件模型,計算了四種模型的截骨量和截骨面積,具體如下:(1)距骨頂弧形截骨(AOA):3153.8 mm~3,877.9 mm~2;(2)距骨頂弧形截骨+外側(cè)面截骨(AOA+LO):3920.3 mm~3,1030.4 mm~2;(3)距骨頂角狀截骨(COA);3892.4 mm~3,947.6 mm~2;(4)距骨頂角狀截骨+外側(cè)面截骨(COA+LO);4432.9 mm~3,1114.3 mm~2。建立了四種假體的三維有限元模型,計算出假體和截骨后距骨的應(yīng)力分布,結(jié)果提示含外側(cè)截骨的AOA+LO組和COA+LO組應(yīng)力分布比不含外側(cè)截骨的AOA和COA更好,弧形截骨和角狀截骨差別很小。3.壓縮實驗結(jié)果提示,不同孔隙率的三種多孔支架的抗壓強度均滿足臨床使用要求。電鏡下觀察到40%孔隙率組的多孔化結(jié)構(gòu)部分被殘留的熔融粉末顆粒堵塞,而更大孔尺寸的60%和80%孔隙率組無堵塞等情況。浸提液相關(guān)的細胞培養(yǎng)和劃痕實驗證明該新型含銅抗菌Co-Cr合金材料無細胞毒性。L929細胞在支架上培養(yǎng)結(jié)果:(1)細胞FM和PI雙染色后觀察,在培養(yǎng)2天時,40%孔隙率組細胞增殖具有優(yōu)勢;但培養(yǎng)4天和8天時,60%孔隙率組相對于40%和80%孔隙率組增殖最為明顯,凋亡更少。(2)細胞存活狀態(tài)下進行了掃描電鏡,觀察到細胞數(shù)量隨培養(yǎng)時間的增加而變化,呈現(xiàn)為逐步增多趨勢;培養(yǎng)8天時,60%孔隙率組的細胞數(shù)量明顯多于其他組,且有統(tǒng)計學(xué)差異。BMSCs在支架上成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果:(1)CCK-8結(jié)果示各培養(yǎng)時間點上三組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異,但在總的細胞數(shù)值上,60%孔隙率組高于其他組。(2)在各培養(yǎng)時間點,激光共聚焦顯微鏡下觀察到60%孔隙率組的細胞增殖更為明顯,凋亡更少。(3)培養(yǎng)2天和4天時,代表ALP活力的OD值在三組間沒有顯著差異,培養(yǎng)8天時,60%孔隙率組明顯大于40%和80%孔隙率組;各培養(yǎng)時間點,60%孔隙率組的OCN含量均大于其他組。4.電鏡下觀察兩組多孔支架的未觀察到粉末顆粒堵塞現(xiàn)象。壓縮實驗結(jié)果提示,不同成分的兩組多孔支架抗壓強度均滿足臨床使用要求。BMSCs在兩組支架上成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果如下:(1)CCK-8結(jié)果示各培養(yǎng)時間點上含銅組與不含銅組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。(2)在各培養(yǎng)時間點,激光共聚焦顯微鏡下觀察到含銅組與不含銅組的細胞增殖、凋亡無顯著差異。(3)在各培養(yǎng)時間點,代表BMSCs成骨分化趨勢的ALP和OCN結(jié)果在含銅組與不含銅組間無顯著差異。多孔支架植入山羊體內(nèi)后的實驗結(jié)果:(1)術(shù)后31天其中一頭羊突然死亡,其數(shù)據(jù)不納入統(tǒng)計分析;(2)獲得了8頭羊各個時間節(jié)點的完整數(shù)據(jù),行統(tǒng)計學(xué)分析的結(jié)果是血清銅離子值在支架植入后逐漸增高,第15天達到高峰,為16.28±3.43μmol/L;(3)術(shù)后獲得8個標本的膝關(guān)節(jié)正側(cè)位片未見支架脫出和移位;(4)Micro-ct數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后的容積灰度值,每個支架隨機選取了1個區(qū)域,各組獲得16個數(shù)據(jù),行統(tǒng)計學(xué)分析的結(jié)果是含銅組的灰度值均值為對142±12,不含銅組為121±10,含銅組高于不含銅組;(5)完成了每組16張硬組織切片的拉曼光譜和掃描電鏡分析,并定義了965 cm~(-1)處的磷酸振動峰為骨組織的特征峰,對比分析得出含銅組支架-骨界面的磷酸根含量及骨含量明顯高于不含銅組;(6)完成了每組16張硬組織切片的亞甲基藍-酸性品紅染色,以及每組16張硬組織切片的Goldner三色染色。數(shù)字化切片在軟件下進行對比分析,得出含銅組骨整合具有優(yōu)勢。最后,定量分析每組32張切片的多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)部和周圍的成骨面積,所獲數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析的結(jié)果是含銅組均多于不含銅組。5.應(yīng)用SLM技術(shù)制造了COA+LO截骨方式的全踝關(guān)節(jié)假體距骨組件,假體與設(shè)計模型一致。假體的滑車關(guān)節(jié)面光滑、反光;骨連接面的多孔結(jié)構(gòu)均勻,與假體主體渾然一體。顯微鏡下觀察到假體表面光滑、無空洞,腐蝕后可見組織形貌與激光掃描路徑一致;多孔結(jié)構(gòu)的孔隙大小和形狀一致,各孔隙間的三維空間互相連接,無粉末顆粒堵塞現(xiàn)象。結(jié)論1.負重位足踝部三維數(shù)字化模型真實地還原了人體雙足站立時踝關(guān)節(jié)-全足各骨的三維空間結(jié)構(gòu),為距骨組件的設(shè)計與分析提供了基礎(chǔ)。2.不同截骨方式的個體化全踝關(guān)節(jié)假體距骨組件模型中,距骨頂角狀截骨聯(lián)合外側(cè)面截骨(COA+LO)的模型具有綜合優(yōu)勢。3.3D打印Co-Cr合金假體的多孔結(jié)構(gòu)參數(shù)為60%孔隙率、孔徑373μm時,有利于細胞增殖和BMSCs成骨分化。4.相同多孔結(jié)構(gòu)參數(shù)的含銅與不含銅Co-Cr合金假體對BMSCs生物學(xué)行為影響無差異,而新型含銅抗菌Co-Cr合金多孔假體在體內(nèi)有利于骨整合。5.提出了個體化假體多孔化骨連接面交互設(shè)計的方法,制造了新型含銅抗菌Co-Cr合金全踝關(guān)節(jié)假體距骨組件。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R318.17

【參考文獻】

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1 Mingjun Li;Li Nan;Dake Xu;Guogang Ren;Ke Yang;;Antibacterial Performance of a Cu-bearing Stainless Steel against Microorganisms in Tap Water[J];Journal of Materials Science & Technology;2015年03期

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