【摘要】：人工肝支持系統(tǒng)是肝衰竭患者等待供肝移植的一種重要過(guò)渡手段。多層平板型人工肝是生物型人工肝的一個(gè)研究熱點(diǎn),而多層平板型人工肝的生物反應(yīng)器中用于細(xì)胞黏附和維持并發(fā)揮功能的膜材料是其中的研究重點(diǎn)。聚氨酯(Polyurethane,PU)材料本身具有良好的物理機(jī)械特性和生物相容性,但聚氨酯材料的疏水性限制了其在細(xì)胞培養(yǎng)方面的應(yīng)用。為提高肝細(xì)胞在材料表面的親和性,本課題對(duì)PU膜表面進(jìn)行氨基化改性和絲膠接枝修飾。用紅外光譜、拉曼光譜、水接觸角測(cè)試、原子力顯微鏡和掃描電鏡等方法對(duì)PU、表面氨基化改性聚氨酯(PU-NH_2)和絲膠接枝聚氨酯(PU-SS)膜片表面化學(xué)基團(tuán)、膜片分子結(jié)構(gòu)、親疏水性、表面粗糙度和表面形貌進(jìn)行表征。將L02和HepG2細(xì)胞分別接種于PU、PU-NH_2、PU-SS膜片表面,用細(xì)胞培養(yǎng)板(TCPS)作為對(duì)照組,比較細(xì)胞在各表面上的生長(zhǎng)增殖和分泌功能,評(píng)價(jià)PU、PU-NH_2、PU-SS膜片的細(xì)胞相容性。并根據(jù)國(guó)家醫(yī)用材料安全性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)PU、PU-NH_2、PU-SS膜片進(jìn)行體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)和血液相容性評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:PU表面氨基化改性在材料表面引入了氨基基團(tuán),使PU膜表面粗糙度從8.8±6.3nm增加到55.4±28.1nm,水接觸角從90.9±0.3°降低到62.7±0.7°。PU-SS表面粗糙度和親水性與PU-NH_2表面無(wú)顯著性差異。L02和HepG2細(xì)胞在PU-SS表面完成貼壁的速度顯著高于PU-NH_2、TCPS和PU表面(P0.01);L02細(xì)胞在PU、PU-NH_2和PU-SS膜片表面鋪展不充分,與TCPS表面有明顯差異。L02細(xì)胞在各表面上的增殖速度存在顯著性差異:TCPSPU-NH_2/PU-SSPU;但L02細(xì)胞在PU-SS表面上白蛋白和尿素氮分泌總量顯著高于PU和TCPS表面。HepG2細(xì)胞在PU、PU-NH_2和PU-SS膜片表面的生長(zhǎng)形態(tài)與TCPS表面未體現(xiàn)出明顯差異,MTT法測(cè)HepG2細(xì)胞培養(yǎng)5天后的細(xì)胞相對(duì)數(shù)與PU無(wú)顯著性差異。但HepG2細(xì)胞在PU-SS表面上細(xì)胞的蛋白合成能力和白蛋白分泌總量顯著高于其他表面。PU、PU-NH_2和PU-SS膜片浸提液無(wú)體外細(xì)胞毒性。膜片血液相容性符合國(guó)家生物材料安全標(biāo)準(zhǔn),PU-NH_2和PU-SS表面有更低的溶血率(0.3±0.5%、-0.2±1.4%)、抗凝血指數(shù)(85.0±1.0%、85.0±1.0%)和血小板消耗率(5.1±1.1%、3.3±2.5%)。綜上所述:PU表面氨基化改性和絲膠修飾影響材料表面的潤(rùn)濕性和粗糙度。使細(xì)胞與其表面接觸面積增大,提高了細(xì)胞的粘附性,更利于細(xì)胞黏附、鋪展和增殖。本課題制備的膜片均能支持細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)和功能,L02和HepG2細(xì)胞在PU-SS表面能同時(shí)滿足快速貼壁、單位時(shí)間內(nèi)有較大細(xì)胞數(shù)量和較高細(xì)胞功能的條件;生物材料安全性實(shí)驗(yàn)也證明PU-SS膜有成為多層平板型人工肝臟膜材料的潛力,有望在多層平板型人工肝支持系統(tǒng)中得到應(yīng)用。
【學(xué)位授予單位】：重慶理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R318.08
【圖文】：

素[30]。由圖1.1可知，肝細(xì)胞在體內(nèi)是多面體形的立體結(jié)構(gòu)，而在體外培養(yǎng)時(shí)，肝細(xì)胞通常會(huì)在培養(yǎng)基質(zhì)表面過(guò)度鋪展增殖而失去其在體內(nèi)的大部分功能[31]。體外培養(yǎng)肝細(xì)胞的重要問(wèn)題是如何達(dá)到體內(nèi)肝細(xì)胞解毒、分泌、合成和生物轉(zhuǎn)化的功能，研究者們構(gòu)建出許多肝細(xì)胞培養(yǎng)模式，如“三明治夾心”培養(yǎng)[32]、微囊包裹培養(yǎng)[33]、細(xì)胞共培養(yǎng)[34]、球形聚集培養(yǎng)[35]等。FMB-BAL[32]是一種典型的“三明治”多層平板生物反應(yīng)器，采用膠原/肝細(xì)胞/膠原的“三明治”夾心培養(yǎng)技術(shù)提高了反應(yīng)器平板材料上肝細(xì)胞的黏附鋪展，并在18天內(nèi)維持功能。肝細(xì)胞在海藻酸鈣凝膠珠內(nèi)能夠長(zhǎng)時(shí)間保持增殖，并持有合成能力和代謝解毒能力[36]。但微囊包裹培養(yǎng)體系細(xì)胞穩(wěn)定性差，微囊工作直徑尚存在爭(zhēng)議，其臨床應(yīng)用受到了一定限制[37]。Kim等[34]將肝細(xì)胞片（HEP片）夾在兩個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞（EC）片之間，制成具有肝細(xì)胞特異性和極性的三層肝組織。成功模擬了體內(nèi)環(huán)境肝細(xì)胞的異質(zhì)性

方式實(shí)現(xiàn)高度集成肝細(xì)胞三維培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)，對(duì)多層平板型人工肝臟所使用的膜材料進(jìn)行研究。采用生物相容性良好的聚氨酯為膜基材，并對(duì)醫(yī)用聚氨酯膜片進(jìn)行表面修飾制得改性膜片，具體研究?jī)?nèi)容如下:(1)聚氨酯膜材料制備及表征：聚氨酯顆粒成膜；聚氨酯材料表面氨基化；材料表面絲膠修飾（EDC/NHS 交聯(lián)）；紅外光譜測(cè)試膜片表面基團(tuán)變化情況；拉曼光譜測(cè)試膜片分子結(jié)構(gòu)的變化情況；掃描電鏡觀察膜片表面形貌；AFM 原子力顯微鏡測(cè)定膜片表面粗糙度變化；水接觸角表征材料表面水的潤(rùn)濕性。(2)分別將 L02 細(xì)胞和 HepG2 細(xì)胞接種于對(duì) PU、PU-NH2和 PU-SS 膜片表面，以細(xì)胞培養(yǎng)板為對(duì)照實(shí)驗(yàn)組，對(duì)細(xì)胞在各表面上的黏附、生長(zhǎng)增殖和細(xì)胞功能進(jìn)行研究，評(píng)價(jià)膜片表面的細(xì)胞相容性。同時(shí)分析比較膜片表面物理性質(zhì)（表面形貌、粗糙度）和表面化學(xué)性質(zhì)對(duì)細(xì)胞的影響。(3)根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)膜片進(jìn)行浸提液細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，血液相容性實(shí)驗(yàn)：溶血率、抗凝血指數(shù)及血小板黏附率，考察膜片的生物安全性。1.5.3 本課題的技術(shù)路線

將 100 片 PU 膜片加入到 200ml 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 7.5%的 MDI 的甲苯溶液中，入質(zhì)量百分比為 2.5%的三乙胺作為催化劑，氮?dú)獗Ｗo(hù)下機(jī)械攪拌，60℃ 2.5h。反應(yīng)結(jié)束后將膜片取出，依次用甲苯、無(wú)水乙醇超聲清洗各三次，面異氰酸酯化的膜片（PU-NCO）。表面異氰酸酯化的膜片加入到 200ml 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2%的乙二胺的甲苯溶60℃反應(yīng) 3h。反應(yīng)結(jié)束后將膜片取出，依次用甲苯、無(wú)水甲醇、去離子清洗各三次，得到表面氨基化的聚氨酯膜片（PU-NH2）。3.3 絲膠接枝 PU 表面的制備別配制濃度為 0.03%、0.05%、0.1%、0.3%、0.5%、1%的 SS 溶液 30m SS、EDC、NHS 質(zhì)量比為 3：3：1 的比例將 EDC 和 NHS 添加到絲膠蛋中，活化絲膠羧基 20min，加入 5 片表面氨基化聚氨酯膜片（直徑為 34mm） 37℃反應(yīng) 24h。反應(yīng)結(jié)束后將膜片取出，用去離子水和 75%酒精超聲清洗備用。

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本文編號(hào)：2801928