【摘要】：皮膚組織工程近年來(lái)發(fā)展迅速,其中利用敷料治療損傷皮膚能夠加快傷口的愈合和功能性恢復(fù)。蠶絲蛋白是一種天然的生物高分子,具有良好的物理化學(xué)特性,而且能夠加工成膜、凝膠、海綿支架及納米纖維等。此外,蠶絲蛋白具有良好的生物相容性和抗氧化、抗菌等特性,能夠促進(jìn)創(chuàng)傷組織再生,作為皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的生物醫(yī)用材料受到更多的關(guān)注。目前創(chuàng)傷敷料對(duì)材料的細(xì)胞相容性和初期黏附性能均具有較高要求,因此,如何提高蠶絲蛋白材料的細(xì)胞相容性是優(yōu)化其在皮膚組織工程應(yīng)用的關(guān)鍵。本研究,首先制備蠶絲蛋白膜,包括家蠶絲素納米纖維膜和柞蠶絲素膜,然后在其表面進(jìn)行多巴胺生物改性,大幅提高其細(xì)胞黏附性能,最后通過(guò)動(dòng)物全層皮膚創(chuàng)傷模型,驗(yàn)證其優(yōu)良的皮膚創(chuàng)傷愈合效果。本論文主要研究?jī)?nèi)容包括以下3部分:(1)多巴胺表面改性絲素納米纖維膜的制備及其皮膚修復(fù)功能首先,利用靜電紡絲技術(shù)制備絲素納米纖維,通過(guò)調(diào)節(jié)紡絲液濃度、電壓、接收距離及紡絲液流速等參數(shù),選擇最佳紡絲條件為濃度7.5%,電壓24KV,接收距離12cm,紡絲液流速0.02mL/min,獲得直徑約400nm的絲素納米纖維;再通過(guò)2mg/mL的多巴胺反應(yīng)液進(jìn)行共培養(yǎng),對(duì)絲素納米纖維進(jìn)行表面改性,并用SEM和XPS進(jìn)行驗(yàn)證。納米纖維表面附著多巴胺顆粒及其N/C摩爾比接近聚多巴胺理論值證實(shí)了多巴胺改性成功;通過(guò)持久性測(cè)試,發(fā)現(xiàn)多巴胺改性涂層能夠持續(xù)7天;接觸角測(cè)試和蛋白吸附實(shí)驗(yàn)證明,多巴胺改性后的絲素納米纖維膜親水性和蛋白吸附量均有所增加,為細(xì)胞黏附提供理論基礎(chǔ);在納米纖維膜表面培養(yǎng)L929細(xì)胞,結(jié)果表明多巴胺改性后的絲素納米纖維膜顯著提高細(xì)胞的初期黏附和鋪展性能,同時(shí)也提高了細(xì)胞的增殖性能;最后,SD大鼠全層皮膚創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn)證明,多巴胺改性絲素納米纖維膜提高創(chuàng)傷愈合速度和創(chuàng)傷組織上皮化,成功促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)。(2)取向型絲素納米纖維的制備及其誘導(dǎo)干細(xì)胞成血管分化研究為提高絲素納米纖維的力學(xué)性能,在制備絲素納米纖維的基礎(chǔ)上,于紡絲液中添加四氧化三鐵納米顆粒,再通過(guò)磁場(chǎng)收集裝置,利用磁場(chǎng)疊加電場(chǎng)的作用,制備取向型絲素納米纖維膜;通過(guò)SEM可以觀察到添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的四氧化三鐵納米顆粒,紡絲30min時(shí)能夠獲得較好取向的絲素納米纖維膜;通過(guò)FTIR分析,發(fā)現(xiàn)添加0.3%的四氧化三鐵納米顆粒不影響絲素納米纖維的二級(jí)結(jié)構(gòu);同時(shí),力學(xué)性能測(cè)試,發(fā)現(xiàn)取向型絲素納米纖維在其取向方向上具有較高的拉伸強(qiáng)度和彈性模量,這為材料力學(xué)性能接觸引導(dǎo)提供基礎(chǔ);而且,通過(guò)振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)測(cè)試發(fā)現(xiàn),添加少量的四氧化三鐵納米顆粒賦予了絲素納米纖維一定的磁響應(yīng)性;間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果表明,取向型絲素納米纖維能夠誘導(dǎo)細(xì)胞取向生長(zhǎng),并且在基礎(chǔ)培養(yǎng)基條件下向成血管方向定向分化;最后,我們利用取向絲素納米纖維膜培養(yǎng)成肌細(xì)胞C2C12,發(fā)現(xiàn)其同樣能夠引導(dǎo)細(xì)胞隨取向方向生長(zhǎng),為其在皮膚深層創(chuàng)傷肌肉修復(fù)方面的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。(3)多巴胺改性柞蠶絲素膜的制備及其皮膚修復(fù)效果為進(jìn)一步提升創(chuàng)傷敷料的細(xì)胞相容性,我們創(chuàng)新性的利用含有RGD多肽序列的柞蠶絲素作為研究材料。首先制備柞蠶絲素膜,利用多巴胺改性柞蠶絲素膜8h和16h,通過(guò)AFM原子力顯微鏡觀察,結(jié)果顯示隨多巴胺改性時(shí)間增長(zhǎng),柞蠶絲素膜表面的多巴胺顆粒逐漸增多,表面粗糙度增加,其多巴胺涂層厚度與反應(yīng)時(shí)間成線性關(guān)系;XPS測(cè)試證明,多巴胺改性后的柞蠶絲素膜表面N/C摩爾比接近聚多巴胺理論值,證明多巴胺成功改性;接觸角測(cè)試證明,多巴胺改性后的柞蠶絲素膜表面親水性增強(qiáng);通過(guò)Zisman方法計(jì)算,多巴胺改性后的柞蠶絲素膜表面自由能從20.61 mJ/m2增加至39.95 mJ/m2,而且蛋白吸附能力顯著性增強(qiáng);在多巴胺改性后的柞蠶絲素膜上培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)現(xiàn),多巴胺改性后的柞蠶絲素膜促進(jìn)了細(xì)胞的黏附和增殖行為;同時(shí),通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),可以證明多巴胺改性后能夠促進(jìn)干細(xì)胞向劃痕處遷移,這對(duì)誘導(dǎo)創(chuàng)傷部位修復(fù)細(xì)胞的遷移從而促進(jìn)創(chuàng)傷愈合是非常重要的;最后,SD大鼠全層皮膚創(chuàng)傷模型實(shí)驗(yàn)證明,相比未改性柞蠶絲素膜和商用紗布,多巴胺改性柞蠶絲素膜能夠加快創(chuàng)傷愈合速度,同時(shí)促進(jìn)創(chuàng)傷部位膠原蛋白的分泌,以及促進(jìn)皮膚附屬器官毛囊和汗腺的再生,這對(duì)皮膚功能性恢復(fù)具有重要意義。本研究通過(guò)多巴胺改性蠶絲蛋白膜,包括絲素納米纖維膜和柞蠶絲素膜,顯著提高其細(xì)胞相容性和細(xì)胞黏附特性。這為蠶絲蛋白在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用研究拓展思路,拓寬了蠶絲蛋白生物材料的應(yīng)用范圍。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R318.08
【圖文】：

其中主要包括細(xì)胞－細(xì)胞相互作用、細(xì)胞－細(xì)胞外基質(zhì)相互作用、逡逑生長(zhǎng)因子－細(xì)胞外基質(zhì)相互作用以及生長(zhǎng)因子－生長(zhǎng)因子相互作用，是一個(gè)復(fù)雜多逡逑因素作用的結(jié)果［２６，２７］。如圖１．３所示，目前創(chuàng)傷治療的策略包括靶向藥物治療，逡逑如抗炎藥物、抗凝血藥物和抗血小板藥物；干細(xì)胞療法，將自體或異體干細(xì)胞種逡逑植在創(chuàng)傷處，從而加快創(chuàng)傷愈合，減少瘢痕攣縮［２８］；基因治療，是指通過(guò)ＤＮＡ逡逑重組技術(shù)，將目的基因?qū)胼d體表達(dá)，獲得對(duì)創(chuàng)傷愈合有益的生長(zhǎng)因子或蛋白［２９］。逡逑此外，研究證明適當(dāng)劑量的機(jī)械力刺激或電刺激能夠促進(jìn)多種生長(zhǎng)因子的分泌及逡逑表徸，促進(jìn)肉芽組織及成纖維細(xì)胞的增殖和分化［２９，３（）］。近年來(lái)，組織工程材料逡逑在皮膚修復(fù)方面的應(yīng)用研究愈來(lái)愈多，通過(guò)將種子細(xì)胞附著在可降解生物材料表逡逑面，植入創(chuàng)傷部位，材料被降解吸附的過(guò)程中新的皮膚組織形成，由此達(dá)到修復(fù)逡逑創(chuàng)傷的目的［３１＿３４］。逡逑悐藤１逡逑Ｎａｎｏｔｌ邋ｂｒｏｉｌｓ邐＿逡逑Ｓｃａｔｈ．ｌｄｓ逡逑Ｖ逡

其中主要包括細(xì)胞－細(xì)胞相互作用、細(xì)胞－細(xì)胞外基質(zhì)相互作用、逡逑生長(zhǎng)因子－細(xì)胞外基質(zhì)相互作用以及生長(zhǎng)因子－生長(zhǎng)因子相互作用，是一個(gè)復(fù)雜多逡逑因素作用的結(jié)果［２６，２７］。如圖１．３所示，目前創(chuàng)傷治療的策略包括靶向藥物治療，逡逑如抗炎藥物、抗凝血藥物和抗血小板藥物；干細(xì)胞療法，將自體或異體干細(xì)胞種逡逑植在創(chuàng)傷處，從而加快創(chuàng)傷愈合，減少瘢痕攣縮［２８］；基因治療，是指通過(guò)ＤＮＡ逡逑重組技術(shù)，將目的基因?qū)胼d體表達(dá)，獲得對(duì)創(chuàng)傷愈合有益的生長(zhǎng)因子或蛋白［２９］。逡逑此外，研究證明適當(dāng)劑量的機(jī)械力刺激或電刺激能夠促進(jìn)多種生長(zhǎng)因子的分泌及逡逑表徸，促進(jìn)肉芽組織及成纖維細(xì)胞的增殖和分化［２９，３（）］。近年來(lái)，組織工程材料逡逑在皮膚修復(fù)方面的應(yīng)用研究愈來(lái)愈多，通過(guò)將種子細(xì)胞附著在可降解生物材料表逡逑面，植入創(chuàng)傷部位，材料被降解吸附的過(guò)程中新的皮膚組織形成，由此達(dá)到修復(fù)逡逑創(chuàng)傷的目的［３１＿３４］。逡逑悐藤１逡逑Ｎａｎｏｔｌ邋ｂｒｏｉｌｓ邐＿逡逑Ｓｃａｔｈ．ｌｄｓ逡逑Ｖ逡

制備ＰＥＧ／明膠復(fù)合膜敷料，具有明顯的抗菌性能，而且相比傳統(tǒng)敷料能夠更快逡逑的促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合。Ｃｈｅｎ等學(xué)者ｆｉｅ７：ｌ利用編織技術(shù)將ＰＬＧＡ多孔編織網(wǎng)與肢原逡逑蛋白復(fù)合，結(jié)構(gòu)如圖１．６所示，在ＰＬＧＡ網(wǎng)孔間形成肢原多孔支架結(jié)構(gòu)。該支架逡逑結(jié)構(gòu)提高了成纖維細(xì)胞的黏附量，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，加速了類真皮結(jié)構(gòu)的逡逑１２逡逑

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本文編號(hào)：2801062