【摘要】：研究背景:骨缺損是指骨的結(jié)構(gòu)完整性被破壞,主要由于創(chuàng)傷、感染、腫瘤、骨髓炎手術(shù)清創(chuàng)、骨腫瘤切除導(dǎo)致,是臨床常見的疾病之一。1986年SchmitzJP等提出臨界骨缺損的概念,將骨缺損長(zhǎng)度達(dá)到長(zhǎng)骨直徑的1.5倍作為骨缺損的臨界值,當(dāng)骨缺損達(dá)到或者超過(guò)臨界值時(shí)骨缺損便無(wú)法自然愈合。據(jù)此諸多學(xué)者將大于長(zhǎng)骨直徑1.5倍的骨缺損稱為大段骨缺損。大段骨缺損會(huì)引起運(yùn)動(dòng)功能喪失并嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量,其修復(fù)一直是臨床上的難題。傳統(tǒng)臨床治療大段骨缺損主要依賴于骨移植,但因移植骨來(lái)源有限、供體-受體免疫排斥反應(yīng)等缺點(diǎn)極大的限制了該方法在臨床上的廣泛應(yīng)用。目前骨組織工程學(xué)的飛速發(fā)展,為治療大段骨缺損帶來(lái)了新的方法,也成為研究的熱點(diǎn)。骨組織工程技術(shù)不僅可以修復(fù)大段骨缺損,且可以按照損傷區(qū)形狀大量制備,克服了自體、異體骨移植所導(dǎo)致的供區(qū)損傷,移植區(qū)免疫排斥和致病性等缺點(diǎn),是公認(rèn)用于大段骨缺損修復(fù)的理想方法。骨組織工程構(gòu)建組織工程骨進(jìn)行體內(nèi)骨缺損修復(fù)主要方式有兩種:膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨。最近的研究證實(shí),與膜內(nèi)成骨相比,軟骨內(nèi)成骨因其有較為豐富的血供,能更好的進(jìn)行大段骨缺損的修復(fù)。軟骨內(nèi)成骨發(fā)育過(guò)程中,肥大軟骨細(xì)胞產(chǎn)生富含X型膠原的無(wú)血管軟骨基質(zhì)、分泌基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP13)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF),從而介導(dǎo)礦化基質(zhì)的形成和血管入侵。伴隨血管侵入的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和造血前體細(xì)胞介導(dǎo)軟骨模板的再吸收和血管化骨的形成。因此肥大軟骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)是軟骨內(nèi)成骨的關(guān)鍵環(huán)節(jié),軟骨細(xì)胞肥大化不足會(huì)阻礙軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中的血管入侵和基質(zhì)礦化,延遲骨的形成。保證間充質(zhì)干細(xì)胞的充足肥大化是研究軟骨內(nèi)成骨為基礎(chǔ)的骨再生的重點(diǎn),深入發(fā)掘其具體分子機(jī)制,將可以為臨床治療大段骨缺損提供新的理論基礎(chǔ)和治療方案。最近幾十年來(lái),納米材料因其獨(dú)特的仿生特征和生物學(xué)特性,已成為組織再生領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。越來(lái)越多的研究表明,部分納米材料可以通過(guò)調(diào)節(jié)干細(xì)胞增殖和分化在骨組織工程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在這些納米材料中,氧化鈰納米顆粒(Ceria nanoparticles,CNPs)因其晶格表面共存三價(jià)與四價(jià)鈰離子(Ce~(3+)/Ce~(4+)),低還原電位使二者可以相互轉(zhuǎn)換,從而賦予了CNPs獨(dú)特的再生潛能及自由基清除能力,已受到人們極大關(guān)注,被廣泛應(yīng)用于納米生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道,CNPs在骨組織中富集,通過(guò)其抗氧化特性增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的粘附與增殖,并進(jìn)一步刺激MSCs的旁分泌促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞在骨形成過(guò)程中的血管化。但CNPs對(duì)MSCs多向分化潛能的影響及其在骨修復(fù)中的作用尚不清楚,揭示CNPs調(diào)節(jié)MSCs多向分化的具體機(jī)制,將可以為基于CNPs為生物材料的骨組織工程提供理論基礎(chǔ),對(duì)臨床治療大段骨缺損具有重要意義。研究目的:本課題以研究CNPs對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)多向分化潛能的影響為基礎(chǔ),探索基于CNPs為生物界面材料的骨組織工程在大段骨缺損修復(fù)中的作用及機(jī)制。材料與方法:1.通過(guò)微乳液法合成CNPs,并以碳酸鹽化合物阿侖膦酸(Alendronate,AL)作為錨定分子,通過(guò)多齒配位的方式穩(wěn)定的結(jié)合在CNPs表面,其氨基末端可以有效結(jié)合羧基化的PEG鏈,從而對(duì)CNPs表面進(jìn)行PEG修飾。2.體外探究PEG修飾后的CNPs分別對(duì)BMSCs成骨、成軟骨、成脂分化的具體影響。(1)通過(guò)透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope,TEM)觀察CNPs在BMSCs中的定位;(2)CCK-8檢測(cè)CNPs對(duì)細(xì)胞增殖的影響;(3)通過(guò)采用甲苯胺藍(lán)、番紅O(Safranin O)、免疫組化染色等不同方法檢測(cè)CNPs對(duì)BMSCs成軟骨分化及肥大分化進(jìn)程的影響,并于誘導(dǎo)后7天、14天分別收取細(xì)胞團(tuán)樣品,采用qRT-PCR及Western blot方法檢測(cè)成軟骨相關(guān)基因Sox9、COMP、Col2a1的表達(dá)情況,于誘導(dǎo)后21天、28天分別收取細(xì)胞團(tuán)樣品,通過(guò)qRT-PCR及Western blot方法檢測(cè)軟骨肥大化相關(guān)基因Runx2、MMP13、Col10a1的表達(dá)情況;(4)采用堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)和茜素紅染色分別檢測(cè)成骨分化中堿性磷酸酶及鈣結(jié)節(jié)的表達(dá)情況,并于成骨誘導(dǎo)后7天、14天、21天分別收取細(xì)胞樣品,通過(guò)qRT-PCR及Western blot檢測(cè)成骨相關(guān)基因Runx2、Osterix2、Col1a1、ALP的表達(dá)情況;(5)采用油紅(Oil red O)染色檢測(cè)CNPs對(duì)BMSCs成脂分化中脂滴的形成情況,分別于誘導(dǎo)后10天、21天收取細(xì)胞樣品,通過(guò)qRT-PCR及Western blot檢測(cè)成脂相關(guān)基因PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ的表達(dá)情況。3.通過(guò)動(dòng)物模型,研究PEG修飾后的CNPs作為組織工程骨的界面修飾材料對(duì)大段骨缺損修復(fù)的效果。(1)將CNPs作為界面修飾材料復(fù)合在脫細(xì)胞骨基質(zhì)(Acellular bone matrix,ACBM)上構(gòu)建組織工程骨支架,將細(xì)胞種植在支架上,通過(guò)掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscope,SEM)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),激光共聚焦顯微鏡(Laser scanning confocal microscope,LSCM)觀察細(xì)胞凋亡情況及中性紅染色檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況,從而評(píng)估構(gòu)建的組織工程骨支架的生物相容性,為體內(nèi)模型植入奠定前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ);(2)建立裸鼠皮下異位成骨模型,將構(gòu)建的組織工程骨支架分別于植入皮下6周、12周后取材,進(jìn)行組織切片染色,觀察成骨方式及檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá);(3)FVB/N小鼠建立股骨中段約3 mm的大段骨缺損模型,將含有CNPs的組織工程骨植入小鼠體內(nèi)12周后取材,microCT觀察骨缺損修復(fù)情況,組織切片染色觀察新骨生成方式,并檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)。4.探究PEG修飾后的CNPs促進(jìn)基于軟骨內(nèi)成骨的大段骨缺損修復(fù)的機(jī)制。我們前期研究表明CNPs可以促進(jìn)DHX15的表達(dá),而文獻(xiàn)表明DHX15可以激活p38 MAPK信號(hào)通路,且p38 MAPK信號(hào)通路在BMSCs軟骨及肥大分化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在本部分研究中,擬采用qRT-PCR及Western blot檢測(cè)CNPs誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化及肥大化過(guò)程中DHX15表達(dá)的變化;在軟骨分化和肥大化分化過(guò)程中使用DHX15干擾質(zhì)粒,qRT-PCR,免疫熒光,Western blot檢測(cè)DHX15的作用;使用干擾質(zhì)粒后加入CNPs,qRT-PCR、免疫熒光、Western blot檢測(cè)CNPs能否通過(guò)影響DHX15的表達(dá)調(diào)控BMSCs的軟骨分化及肥大化,繼而調(diào)控軟骨內(nèi)成骨進(jìn)程。研究結(jié)果:1.我們通過(guò)微乳液法穩(wěn)定合成CNPs,且粒徑平均大小維持在3 nm,PEG修飾后CNPs能更好的分散在溶劑中。2.BMSCs軟骨分化實(shí)驗(yàn)表明,CNPs能促進(jìn)軟骨相關(guān)基因Sox9、COMP、Col2a1及肥大相關(guān)基因Runx2、MMP13、Col10a1的表達(dá);BMSCs成骨分化實(shí)驗(yàn)表明,CNPs抑制鈣結(jié)節(jié)和堿性磷酸酶的形成及成骨相關(guān)基因Runx2、Osterix2、Col1a1的表達(dá);BMSCs成脂分化實(shí)驗(yàn)表明,CNPs能抑制脂滴的形成及成脂相關(guān)基因PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ的表達(dá)。3.裸鼠皮下異位成骨實(shí)驗(yàn)表明,CNPs能促進(jìn)血管形成和新骨生成。4.小鼠原位股骨中段大段骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)表明,CNPs能增強(qiáng)基于軟骨內(nèi)成骨的臨界尺寸的骨缺損再生。5.DHX15能激活p38 MAPK的磷酸化,干擾DHX15將抑制BMSCs的軟骨分化及肥大化,CNPs能促進(jìn)DHX15的表達(dá)并部分回復(fù)下調(diào)的基因表達(dá)。結(jié)論:1.CNPs可以促進(jìn)BMSCs的軟骨分化及肥大化,抑制BMSCs的成骨分化和成脂分化。2.CNPs能通過(guò)軟骨內(nèi)成骨的方式促進(jìn)裸鼠皮下異位成骨及原位大段骨缺損修復(fù)。3.DHX15是BMSCs軟骨分化及肥大化過(guò)程中的調(diào)控因子,且DHX15通過(guò)激活p38MAPK磷酸化發(fā)揮調(diào)控作用。4.CNPs通過(guò)激活DHX15/p38 MAPK信號(hào)通路調(diào)控BMSCs的軟骨分化和肥大化,以促進(jìn)軟骨內(nèi)成骨進(jìn)程。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R318.08

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本文編號(hào)：2794647