【摘要】：干細(xì)胞在生物醫(yī)學(xué)工程中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛,應(yīng)對(duì)日漸增大的干細(xì)胞需求,低溫保存干細(xì)胞顯得尤為重要。傳統(tǒng)的慢速冷凍會(huì)造成細(xì)胞不可避免的損傷,常規(guī)的玻璃化保存細(xì)胞往往需要高濃度的滲透性低溫保護(hù)劑,使樣品在冷凍過(guò)程中完全玻璃化,降復(fù)溫過(guò)程中沒(méi)有冰晶形成,這樣才能確保細(xì)胞冷凍復(fù)溫后有較高的存活率。人們通常為了減少玻璃化保存過(guò)程中胞內(nèi)冰的形成一方面加高滲透性低溫保護(hù)劑的濃度,另外一方面減小玻璃化保存樣品的體積,增加降溫和復(fù)溫過(guò)程中的溫度變化速率。高濃度(≈8M)、有毒的低溫保護(hù)劑往往會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不可逆的損傷,減小冷凍樣品體積往往使冷凍過(guò)程變得復(fù)雜,增加操作人員的工作量,細(xì)胞在冷凍過(guò)程的損失率增加。針對(duì)目前玻璃化保存存在的問(wèn)題,本文在損傷機(jī)理的研究中,通過(guò)冷熱臺(tái)實(shí)現(xiàn)5℃/min、10℃/min和15℃/min三種不同的降溫速率,再通過(guò)顯微鏡上攝像機(jī)記錄下細(xì)胞在不同降溫速率下體積變化,得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)數(shù)學(xué)公式擬合得到間充質(zhì)干細(xì)胞在冷凍過(guò)程中細(xì)胞膜對(duì)水輸運(yùn)兩個(gè)重要參數(shù),滲透性系數(shù)Lpg和水輸運(yùn)的活化能ELp,并用它設(shè)計(jì)更好的冷凍方案,從機(jī)理上了解冷凍過(guò)程中減少細(xì)胞的溶液損傷和胞內(nèi)冰損傷。同時(shí)采用20℃/min、30℃/min和60℃/min三種不同的降溫速率測(cè)試間充質(zhì)干細(xì)胞在冷凍過(guò)程中胞內(nèi)冰形成的概率,找到合適降溫速率,減少冷凍過(guò)程中胞內(nèi)冰對(duì)細(xì)胞的損傷。本文在玻璃化保存輔助材料上,采用水凝膠來(lái)抑制玻璃化冷凍和復(fù)溫過(guò)程中胞內(nèi)冰的形成,以往水凝膠封裝玻璃化保存要求完全玻璃化,因此要求微膠囊直徑足夠小(直徑250μm)和低溫保護(hù)劑濃度足夠高(≈8M),本文采用核殼結(jié)構(gòu)的大體積水凝膠微膠囊(直徑500μm)裝載豬的脂肪干細(xì)胞部分玻璃化保存(微膠囊外邊有冰晶形成,微膠囊內(nèi)部由于水凝膠對(duì)冰晶抑制作用,無(wú)冰晶形成,因此,避免了胞內(nèi)冰對(duì)細(xì)胞的損傷),大大提高了封裝效率,本研究中的大體積微膠囊可以實(shí)現(xiàn)對(duì)大體積(十幾到幾百毫升的樣品)細(xì)胞懸浮液(在細(xì)胞治療和移植中使用頻繁)的快速封裝。并使用超低濃度的低溫保護(hù)劑(≈2 M滲透性低溫保護(hù)劑加0.5M非滲透性低溫保護(hù)劑),直接投入到液氮中進(jìn)行冷凍,冷凍復(fù)蘇后得到的細(xì)胞存活率較高(代替完全玻璃化或者帶有可見(jiàn)冰的部分玻璃化)。使用不同組份四組的低溫保護(hù)劑條件下,水凝膠封裝后能夠大大提高細(xì)胞冷凍后的存活率(四種不同配方的低溫保護(hù)劑封裝后冷凍保存得到的細(xì)胞存活率依次為:24%到73%,25%到71%,25%到63%和21%到56%)。本研究表明水凝膠微膠囊在細(xì)胞的冷凍和復(fù)溫過(guò)程中能夠有效地抑制冰晶的形成和傳播。大體積的微膠囊在干細(xì)胞的治療方面存在著很大的潛在的應(yīng)用價(jià)值。本文同時(shí)對(duì)微膠囊的產(chǎn)生方法上進(jìn)行改進(jìn),與傳統(tǒng)的微液滴是通過(guò)油相和水相或者水相和油相兩相剪切形成的相比,本研究采用三相全水生物相容性較好的溶劑快速生成海藻酸鈉微膠囊的方法,有效的保護(hù)細(xì)胞活性。本文中的方法相比傳統(tǒng)水-水相生成微膠囊的方法,能夠靈活對(duì)微膠囊的良徑、殼核相對(duì)厚度進(jìn)行調(diào)節(jié),使用的外圍溶液是與細(xì)胞相容性較好的水溶性溶液,這使得在交聯(lián)生成水凝膠微膠囊的過(guò)程中細(xì)胞或其他生物樣品的活性不會(huì)受到損傷。封裝豬的脂肪干細(xì)胞,用于3D培養(yǎng),由于整個(gè)封裝和交聯(lián)過(guò)程中,細(xì)胞都處于生物相容性較好的溶液中,細(xì)胞受到損傷較小,細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況良好,細(xì)胞在第七天已經(jīng)生長(zhǎng)成團(tuán)并且沒(méi)有出現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡。本文還在大體積微膠囊封裝保存干細(xì)胞的基礎(chǔ)上,把最外層溶液用氯化鈣溶液替換油相,生成具有殼核結(jié)構(gòu)的微纖維,進(jìn)一步提高封裝效率,同時(shí)微纖維的形狀與生物的血管、肌腱和神經(jīng)比較類(lèi)似,對(duì)更進(jìn)一步3D培養(yǎng)仿生學(xué)有重要的意義。采用微纖維狀水凝膠封裝豬的脂肪干細(xì)胞(pADSCs)懸浮液,且用紗布包裹后直接投入液氮中,實(shí)現(xiàn)超低濃度低溫保護(hù)劑條件下的玻璃化保存。尤其在1M滲透性(0.5M丙二醇和0.5乙二醇)低溫保護(hù)劑條件下玻璃化保存后存活率超過(guò)70%,本方法外層連續(xù)相使用了 CaCl2溶液代替以往的油相,避免了從油相中把微纖維分離出來(lái)的操作。該研究用微纖維封裝細(xì)胞,封裝效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于微膠囊封裝細(xì)胞。因?yàn)槲⒗w維和微膠囊相比,易于盛放,不需要特殊的冷凍容器盛放,可以直接投入液氮或者液氮蒸汽中玻璃化保存,且直接投放液氮或者液氮蒸汽中,降溫速率要遠(yuǎn)大于用容器盛放的樣品的降溫速率。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R318.52
【圖文】：

的兩因素假說(shuō)這是一個(gè)根據(jù)冷凍過(guò)程中溶液的結(jié)冰量，并對(duì)滲透過(guò)程進(jìn)行定逡逑量分析后建立起來(lái)的方程。因?yàn)楦鞣N細(xì)胞體積不同，他們細(xì)胞膜對(duì)水的滲透量也逡逑不同，所以在低溫保存過(guò)程中不同的細(xì)胞有著不同的最佳降溫速率。如下圖１．１逡逑中ａ圖所示：如果降溫速率太慢，細(xì)胞外溶液相對(duì)于細(xì)胞內(nèi)溶液優(yōu)先接觸外邊冷逡逑源而慢慢結(jié)冰。因此，細(xì)胞外溶液濃度會(huì)不斷升高，細(xì)胞內(nèi)外形成滲透壓差，細(xì)逡逑胞內(nèi)水分將不斷滲出，細(xì)胞處于高濃度的溶液環(huán)境下，導(dǎo)致細(xì)胞強(qiáng)烈收縮，如果逡逑細(xì)胞過(guò)度收縮會(huì)造成細(xì)胞骨架和一些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，即細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間處于高逡逑濃度的溶液中會(huì)受到損傷［５＿８］，這就是造成細(xì)胞損傷的第一個(gè)因素即溶液損傷；逡逑同時(shí)，如果冷凍速度過(guò)快，細(xì)胞內(nèi)溶液來(lái)不及往細(xì)胞外滲透，因過(guò)冷而結(jié)冰，這逡逑就是造成細(xì)胞低溫?fù)p傷的第二個(gè)因素，被稱為胞內(nèi)冰損傷。那么在這兩個(gè)因素的逡逑共同制約下

圖１．２封裝玻璃化保存結(jié)構(gòu)示意圖［３６〗逡逑究現(xiàn)狀逡逑細(xì)胞在添加、去除保護(hù)劑和冷凍過(guò)程中的跨膜水輸運(yùn)逡逑由于技術(shù)條件的限制，細(xì)胞保存絕大數(shù)條件下需要添加去除低常用的滲透性低溫保護(hù)劑（ＣＰＡ）—二甲亞砜（ＤＭＳＯ）、丙二醇（例。通常情況下，細(xì)胞膜對(duì)滲透性低溫保護(hù)劑的滲透效率要小于效率。所以，當(dāng)這些低溫保護(hù)劑溶液加入到細(xì)胞懸浮液中，細(xì)胞增大，細(xì)胞內(nèi)部滲透壓短時(shí)間內(nèi)基本保持不變，細(xì)胞內(nèi)外就會(huì)產(chǎn)胞內(nèi)水溶液會(huì)透過(guò)細(xì)胞膜流出細(xì)胞，細(xì)胞體積會(huì)隨之收縮，隨著低溫保護(hù)劑不斷向細(xì)胞內(nèi)部滲透，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓最終達(dá)到平衡，復(fù)到接近于添加保護(hù)劑前的正常體積，此時(shí)細(xì)胞處在等滲溶液環(huán)

和Ｐ．邋Ｍａｚｕｒ等人，均相成核和異相成核是過(guò)冷溶液產(chǎn)生冰晶的兩個(gè)成核方式。其逡逑中，異相成核的冰晶是由雜質(zhì)粒子、瑕疵表面和晶體上的分子團(tuán)聚集形成的；均逡逑相成核的冰晶則是由純水中產(chǎn)生的隨機(jī)熱波動(dòng)形成的。如下圖１．３所示，Ｍ．邋Ｔｏｎｅｒ逡逑等人認(rèn)為均相成核和異相成核同時(shí)存在，誘發(fā)冰晶形成的核子來(lái)自細(xì)胞內(nèi)部，即逡逑通常所說(shuō)的體積誘發(fā)成核機(jī)制（Ｖｏｌｕｍｅ邋Ｃａｔａｌｙｅｄ邋Ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ，ＶＣＮ），這是因?yàn)殄义霞?xì)胞內(nèi)一些微小粒子在低溫條件下，可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)水結(jié)晶。此外，在細(xì)胞內(nèi)結(jié)逡逑晶前，細(xì)胞外水溶液先結(jié)晶，細(xì)胞外的冰晶可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械力和化學(xué)作用逡逑導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，間接為細(xì)胞內(nèi)冰晶形成提供場(chǎng)所，就是表面誘發(fā)機(jī)理逡逑（Ｓｕｒｆａｓｅ邋Ｃａｔａｌｙｅｄ邋Ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ，ＳＣＮ）。Ｐ．Ｍａｚｕｒ等人認(rèn)為細(xì)胞膜外冰晶通過(guò)細(xì)胞逡逑膜上的微孔進(jìn)入細(xì)胞，這些微小冰晶的介入，為細(xì)胞內(nèi)部冰晶形成提供了必要的逡逑場(chǎng)合

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本文編號(hào)：2789067