【摘要】：背景:20世紀(jì)90年代以來(lái),研究對(duì)象的微型化成為自然科學(xué)和工程技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)之一,微流控芯片技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。微流控芯片的主要技術(shù)特征是在微米尺度空間內(nèi)操控流體進(jìn)行常規(guī)物理、化學(xué)和生物實(shí)驗(yàn),因此又稱為“芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab on a chip)”。仿生微流體細(xì)胞培養(yǎng)裝置,也稱為“芯片上的器官”。具體到仿生肺芯片中,通過(guò)對(duì)肺部氣-液交界的動(dòng)態(tài)微環(huán)境的模擬,已經(jīng)在急性肺損傷、哮喘和肺癌等疾病的研究中取得了一些突破。慢性阻塞性肺疾病(COPD)的發(fā)生與長(zhǎng)期的有毒氣溶膠暴露相關(guān)。其基本病理特征之一是由氣道炎癥引起的、不完全可逆的氣流受限。香煙煙霧暴露是COPD和肺癌的危險(xiǎn)因素。COPD的組織學(xué)改變主要是氣道上皮的重構(gòu)和組織纖維化,炎癥細(xì)胞向黏膜、黏膜下層浸潤(rùn),導(dǎo)致供血不足和上皮細(xì)胞死亡;另一方面,肺癌的典型病理改變?yōu)榧?xì)胞不受控增殖和新血管網(wǎng)絡(luò)形成。這兩種病理轉(zhuǎn)變之間的機(jī)制引起了廣泛關(guān)注。由于肺部理化環(huán)境復(fù)雜,存在著氣-液交界和多種細(xì)胞的相互作用,現(xiàn)有的體外細(xì)胞模型未能盡量模擬這種特征,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型則存在著耗時(shí)長(zhǎng)、成功率低的缺點(diǎn)。器官芯片的出現(xiàn)為解決上述問(wèn)題提供了條件。在本實(shí)驗(yàn)中,我們應(yīng)用微流控芯片技術(shù),構(gòu)建了一種能夠模擬肺部氣-液交界的動(dòng)態(tài)微環(huán)境的仿生肺芯片模型,完成了支氣管上皮和血管內(nèi)皮的氣液雙相動(dòng)態(tài)共培養(yǎng)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-3(STAT3)與炎癥、細(xì)胞增殖、腫瘤的血管生成和轉(zhuǎn)移有關(guān)。最近的研究表明,香煙煙霧和其他多種致癌因子、放射線、病毒、和炎癥因子能夠激活STAT3,調(diào)控c-fos、c-myc、cyclin-D1等基因的表達(dá),導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。STAT3的激活也和化療和放療抵抗相關(guān),在腫瘤性疾病的各個(gè)階段中均能起到一定作用。本研究中我們提出假設(shè):香煙煙霧進(jìn)入肺單元后,對(duì)上皮造成直接損傷,導(dǎo)致可溶性物質(zhì)溶于血液,形成肺單元局部的慢性炎癥微環(huán)境,破壞肺氣-血屏障,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變,最終導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)變的發(fā)生。為了驗(yàn)證這個(gè)假說(shuō),我們?cè)诜律涡酒Ｐ蜕贤瓿闪酥夤苌掀ぜ?xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的氣液雙相動(dòng)態(tài)共培養(yǎng),并進(jìn)行了持續(xù)香煙煙霧暴露實(shí)驗(yàn),以明確STAT3的作用。方法:1.仿生肺芯片的設(shè)計(jì)和加工(1)采用具有良好的生物相容性和透光性的聚二甲基硅氧烷作為芯片基材,采用SU-8光刻法進(jìn)行芯片的加工。(2)芯片設(shè)計(jì)為多層結(jié)構(gòu),內(nèi)部結(jié)構(gòu)尺寸模擬真實(shí)的肺單元平均體積,通過(guò)規(guī)律抽吸模擬呼吸運(yùn)動(dòng)對(duì)肺單元的拉伸。(3)采用鼠尾膠原對(duì)芯片內(nèi)部進(jìn)行修飾后完成細(xì)胞的氣液雙相共培養(yǎng),采用活細(xì)胞示蹤法驗(yàn)證細(xì)胞的生存率。2.在肺芯片模型上進(jìn)行香煙煙霧暴露(1)CCK8法檢測(cè)支氣管上皮細(xì)胞BEAS2B和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC對(duì)香煙煙霧提取物的敏感性。(2)ELISA法檢測(cè)肺芯片上香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的炎癥水平。(3)RT-PCR法檢測(cè)持續(xù)香煙煙霧暴露后支氣管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中頂端連接復(fù)合體的mRNA水平。(4)蛋白印跡法檢測(cè)兩種細(xì)胞中STAT3和相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化。(5)CCK8法檢測(cè)支氣管上皮細(xì)胞BEAS2B和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC對(duì)小分子藥物HJC0152的敏感性。(6)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HJC0152對(duì)持續(xù)香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞周期的影響。(7)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)HJC0152對(duì)持續(xù)香煙煙霧誘導(dǎo)的細(xì)胞STAT3轉(zhuǎn)錄激活的影響(8)蛋白印跡方法STAT3通路的相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:1.仿生肺芯片模型可以用于完成動(dòng)態(tài)氣液雙相共培養(yǎng),芯片上的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。2.在仿生肺芯片模型中進(jìn)行香煙煙霧暴露,能夠誘導(dǎo)動(dòng)態(tài)共培養(yǎng)體系發(fā)生炎癥因子表達(dá)。其中炎癥因子IL-6的水平明顯高于靜態(tài)培養(yǎng)中的IL-6水平。IL-6/STAT3信號(hào)通路在香煙煙霧引起的肺部炎癥反應(yīng)中起到重要作用。3.持續(xù)的香煙煙霧暴露會(huì)引起肺氣-血屏障的破壞;支氣管上皮細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的頂端連接復(fù)合體均發(fā)生了降解。煙霧暴露會(huì)引起上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變。4.香煙煙霧暴露引起支氣管肺上皮細(xì)胞中c-myc、cyclin D1和p-ERK的表達(dá)升高。磷酸化STAT3水平的升高與細(xì)胞增殖活躍有相關(guān)性。5.小分子通路抑制劑HJC0152能夠抑制STAT3的轉(zhuǎn)錄活性,降低STAT3磷酸化程度,進(jìn)而減少c-myc、cyclin D1的表達(dá)。經(jīng)持續(xù)的香煙煙霧刺激后支氣管上皮細(xì)胞BEAS2B細(xì)胞周期中G1期減少,S期細(xì)胞比例增多;HJC0152可以部分逆轉(zhuǎn)這種趨勢(shì)。結(jié)論:1、應(yīng)用微流控技術(shù)構(gòu)建的仿生肺芯片模型能夠模擬肺部的氣液交界微環(huán)境,對(duì)上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)態(tài)的共培養(yǎng)。2、在仿生肺芯片模型上,IL-6/STAT3通路在香煙煙霧引起肺部炎癥因子表達(dá)中發(fā)揮作用,持續(xù)的香煙煙霧暴露引起肺氣-血屏障的破壞和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。3、STAT3的激活會(huì)引起原癌基因c-myc和cyclin D1表達(dá)上調(diào),在芯片模型中再次證實(shí)了STAT3是香煙煙霧引起的炎癥發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵作用位點(diǎn)。4、通路阻滯劑HJC0152可能在香煙煙霧引起的肺部炎癥發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變的過(guò)程中起到抑制作用。綜上所述,我們的研究證明了微流控仿生芯片在模擬肺部復(fù)雜微環(huán)境與香煙煙霧暴露之間的相互作用方面具有優(yōu)勢(shì)。STAT3可能是炎癌轉(zhuǎn)化的調(diào)控因子之一,但其具體的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。同時(shí),STAT3通路阻滯劑HJC0152也有可能在香煙煙霧相關(guān)的肺炎和惡性轉(zhuǎn)變中發(fā)揮作用,在臨床上具有的潛在應(yīng)用價(jià)值,為肺癌的研究提供了新的思路。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R318
【圖文】：

在芯片上加工出微米級(jí)尺寸的通道（10-100μM）可以對(duì)單細(xì)胞（10-20μM）進(jìn)行操縱和分析。通過(guò)對(duì)芯片進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)，將樣品引入微流通道后，經(jīng)由施加電場(chǎng)力、靜壓力等手段，能夠在特定的位置實(shí)現(xiàn)對(duì)某一類別細(xì)胞的捕獲。這種單細(xì)胞捕獲芯片已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于體外即時(shí)診斷（point-of-caretesting，POCT），比如轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤的外周循環(huán)腫瘤細(xì)胞 （circulating tumor cells，CTCs）檢測(cè)[14]。而在細(xì)胞培養(yǎng)芯片中進(jìn)行結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，可以量化細(xì)胞的遷移侵襲能力[15]和黏附力[16]。在此基礎(chǔ)之上設(shè)計(jì)出的三維細(xì)胞共培養(yǎng)芯片，可以對(duì)腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用進(jìn)行深入研究[17]。相比于傳統(tǒng)的靜態(tài)體外細(xì)胞模型和體內(nèi)模型，微流控芯片細(xì)胞模型也具有一定的優(yōu)勢(shì)（圖 1.1）。

之上還建立了集成度更高的多器官功能芯片或人體芯片（multi-organ-on-chip，body-on-chip），用于預(yù)測(cè)器官或系統(tǒng)間的相互作用[8, 9]。器官芯片設(shè)計(jì)和加工的基本原則之一是對(duì)體內(nèi)關(guān)鍵作用單元的微環(huán)境進(jìn)行最大程度的模擬。具體到仿生肺芯片中，其首要條件就是再現(xiàn)肺-毛細(xì)血管界面結(jié)構(gòu)和周期性的呼吸運(yùn)動(dòng)[22]。常用的器官芯片多采用具有良好彈性的 PDMS 進(jìn)行加工，這種芯片基材具有高透光性，可以使用高分辨率的顯微鏡觀察肺部疾病過(guò)程中的多種細(xì)胞之間的相互作用。通常肺芯片被設(shè)計(jì)成為兩層培養(yǎng)腔結(jié)構(gòu)，中間用多孔薄膜分隔開(kāi)。通過(guò)對(duì)與培養(yǎng)腔平行的空腔規(guī)律抽吸，可以使上下兩層培養(yǎng)腔中的多孔薄膜規(guī)律伸縮，借此來(lái)模擬正常肺部的呼吸運(yùn)動(dòng)。到目前為止在肺芯片上已經(jīng)建立了小氣道疾病、肺水腫和血栓形成、哮喘和外源性急性肺損傷等疾病的模型[23]。

圖 1.2 微流控裝置研究癌相關(guān)性成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲示意圖腫瘤球（Tumorsphere）也被集成到腫瘤侵襲的微流控模型中。Choi 等人開(kāi)發(fā)了一種仿生微系統(tǒng)，再現(xiàn)了乳腺導(dǎo)管原位癌的三維組織結(jié)構(gòu)。芯片模型由嵌入到三維支架中共培養(yǎng)的 MCF10 細(xì)胞、人乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞組成。在模仿腺體自然結(jié)構(gòu)的微流控體系內(nèi)，對(duì)這幾種細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。該研究中，研究者將微流控裝置作為藥物篩選平臺(tái)，在體系內(nèi)引入用紫杉醇后發(fā)現(xiàn)，即便出現(xiàn)了一定程度的腫瘤細(xì)胞的耐藥現(xiàn)象，紫杉醇的使用仍然能夠阻止腫瘤細(xì)胞對(duì)周圍基質(zhì)的侵犯[30]。

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本文編號(hào)：2782532