【摘要】：動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是影響人類健康和生活質(zhì)量的最嚴(yán)重的心血管疾病。As病理過程全程均有炎癥反應(yīng)的參與,并且涉及血管細(xì)胞,包括內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,Ecs)和平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells,SMCs)等。已有的研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)皮細(xì)胞(EC)來源的抗炎microRNAs可通過外泌體傳遞給單核細(xì)胞,抑制單核細(xì)胞的激活,進(jìn)而影響血管炎癥。目前,針對動脈粥樣硬化等血管疾病的治療方法中,血管組織工程是比較有發(fā)展前景的一種。對于工程血管材料,大量的研究和報道都集中在改良血管材料的化學(xué)組成或者添加不同的生長因子或藥物等方面,而最新的研究表明,材料的物理性質(zhì)對細(xì)胞行為的調(diào)控有非常重要的作用,我們的前期研究已經(jīng)表明,細(xì)胞的形態(tài)可以受到材料的表面微觀形貌的調(diào)控,甚至材料表面的微觀形貌可以影響干細(xì)胞的定向分化。但是目前利用材料的物理特性影響內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)控炎癥的作用尚未有報道。本課題的假設(shè)是,生物材料表面特定的微觀形貌可以調(diào)節(jié)血管ECs與免疫細(xì)胞之間的交流,達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)的目的。為了驗證我們的假設(shè),本課題設(shè)計了如下的研究體系:(1)我們使用一種常用的人工血管材料,聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS),制備了具有平行微槽(microgrooves,G)結(jié)構(gòu)細(xì)胞培養(yǎng)基底,以沒有凹槽的平滑PDMS材料(flat,F)作為對照。(2)利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)來體外模擬動脈的EC。(3)用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)活化的THP-1細(xì)胞株代表AS早期硬化斑塊周圍的炎癥細(xì)胞,與HUVEC共培養(yǎng),研究兩者之間的調(diào)控關(guān)系。利用上述研究體系,我們研究了平行微槽結(jié)構(gòu)的PDMS是否可以影響HUVEC外泌體分泌和基因的表達(dá),進(jìn)一步,HUVEC的這些改變是否可通過外泌體傳遞到脂多糖LPS活化的THP-1,進(jìn)而影響THP-1的炎癥反應(yīng)。我的研究結(jié)果分為以下幾個部分:(1)初步研究結(jié)果表明,當(dāng)PDMS膜的凹槽結(jié)構(gòu)為10?m寬,3?m深,10?m間距時,在其表面培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化,與光滑表面的多角形不同,被拉長成長梭形,且沿凹槽方向平行規(guī)整排列。microRNA表達(dá)量分析顯示很多microRNA水平受到影響,尤其是炎癥相關(guān)的microRNAs,如miR-10a、miR-21、miR-146a、miR-181b等,表達(dá)都顯著上調(diào)(P0.001),而且這些microRNA對應(yīng)的靶基因表達(dá)都受到抑制(P0.05)。(2)進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),隨著HUVEC細(xì)胞內(nèi)microRNAs的上調(diào),與光滑表面相比,形態(tài)被微槽改變的HUVEC可分泌更多外泌體(P0.05)。與此同時,我們對HUVEC中上調(diào)的miR-10a、miR-21、miR-146a、miR-181b等抗炎microRNA在外泌體中的水平進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)外泌體中攜帶的miR-10a水平顯著上升(P0.01)。(3)為進(jìn)一步研究外泌體miR-10a上升的生物學(xué)意義,在LPS活化的THP-1與HUVEC共培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)與形貌改變的HUVEC共培養(yǎng)的THP-1中miR-10a的表達(dá)也顯著上升(P0.05),相應(yīng)的,其靶基因MAP3K7表達(dá)下調(diào)(P0.01)。激活的THP-1分泌的炎癥細(xì)胞因子白介素-6(Interlukin-6,IL-6),白介素-1?(Interlukin-1?,IL-1?)以及腫瘤壞死因子?(Tumor necrosis factor-?,TNF-?)的表達(dá)均顯著下降(P0.001),說明其炎癥反應(yīng)受到了顯著的抑制。同時,由于形貌改變的HUVEC所表達(dá)的粘附因子(VCAM-1、ICAM-1、E-selectin)和趨化因子(MCP-1)均發(fā)生顯著下調(diào)(P0.05),在黏附實驗中發(fā)現(xiàn)THP-1的粘附減少。THP-1中,免疫調(diào)節(jié)基因如轉(zhuǎn)換生長因子(Transforming Growth Factor,TGF-?1),白介素-10(Interlukin-10,IL-10)以及甘露糖受體(mannose receptor,MRC1)表達(dá)都有不同程度上調(diào),提示在THP-1向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中,形貌改變的HUVEC還可能調(diào)節(jié)THP-1的極化,有使其向M2型分化的趨勢。以上結(jié)果說明,形貌改變的HUVEC確實可以通過旁分泌途徑,通過抑炎microRNAs抑制THP-1的炎癥反應(yīng)。(4)為了進(jìn)一步排除共培養(yǎng)體系中THP-1可能分泌的外泌體以及其它細(xì)胞外蛋白因子的反作用,我們還采用了轉(zhuǎn)上清體系進(jìn)行了上述結(jié)論的驗證,即將HUVEC培養(yǎng)上清,加到THP-1中進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)結(jié)果和共培養(yǎng)體系完全一致,即THP-1中miR-10a的表達(dá)顯著上升(P0.05)。在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上,為進(jìn)一步驗證HUVEC上清液中對THP-1發(fā)生作用的主要因素是外泌體,在轉(zhuǎn)上清體系中,預(yù)先加入外泌體抑制劑抑制HUVEC外泌體的分泌,FACS結(jié)果表明外泌體數(shù)量顯著下降(P0.05),并且外泌體中miR-10a表達(dá)水平都有大幅度降低(P0.001),THP-1中miR-10a水平也相應(yīng)顯著下降(P0.001),表明HUVEC抑制THP-1的功能的旁分泌途徑中,外泌體起了重要的作用。綜上,我們將生物材料的表面微觀結(jié)構(gòu)與血管炎癥聯(lián)系起來,探索了具有表面微觀結(jié)構(gòu)的PDMS膜對于HUVEC及其外泌體的影響,以及探索這個影響如何通過外泌體傳遞到下游靶細(xì)胞THP-1,調(diào)節(jié)其炎癥反應(yīng)。外泌體作用的加入為AS的致病過程提供了理論上的補(bǔ)充,并且為生物醫(yī)用材料的設(shè)計優(yōu)化提供新的思路。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R543.5;R318.08
【圖文】：

子的表達(dá)和滲透具有重要的影響[9]。如圖1-1在血管平流層，內(nèi)皮細(xì)胞沿著血流的方向 致平行生長并且有完整的細(xì)胞間連接，而湍流處內(nèi)皮細(xì)胞隨機(jī)方向生長，并處于較高的激活狀態(tài)。相對于血液平流層，湍流處的內(nèi)皮滲透性較高，細(xì)胞粘附因子增加，導(dǎo)致血流白細(xì)胞如單核細(xì)胞向血管內(nèi)皮組織的粘附。 旦粘附，單核細(xì)胞能通過受損的內(nèi)皮連接處進(jìn)入血管壁和內(nèi)皮下組織，這 破壞激活內(nèi)皮組織導(dǎo)致血小板粘附。血小板粘附促使生物材料表面血栓形成，導(dǎo)致血管的堵塞[10]。在回流處

43]。根據(jù)以上研究，實驗中我們將具有表面平行凹槽結(jié)構(gòu)PDMS基質(zhì)（如圖1-2所示用于制作PDMS膜的硅片模板）模擬血流對于內(nèi)皮細(xì)胞的形貌和功能的改變，驗證相對于平滑材料上生長的無序的內(nèi)皮細(xì)胞，形態(tài)被拉長的細(xì)胞對炎癥反應(yīng)的影響。圖 1-2 用于制作 PDMS 膜模板具有的光滑和凹槽結(jié)構(gòu)的表面Figure 1 Flat and grooved surface of templates used to fabricate PDMS membranes（圖片來源：Gasiorowski J Z, Liliensiek S J, Russell P, et al.Alterations in Gene Expression ofHuman Vascular Endothelial Cells Associated with Nanotopographic Cues[J]. Biomaterials, 2010,31(34):8882.）1.3 炎癥在動脈粥樣硬化中作用動脈粥樣硬化是心血管疾病的 大誘因，而炎癥是動脈粥樣硬化的 大發(fā)病機(jī)制[44-47]。人類對動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)的研究已逾百年，眾多發(fā)病假

本特征[45, 46]。病變發(fā)展過程中，如圖1-3從脂質(zhì)條紋到纖維斑塊再到粥樣斑塊，乃至不穩(wěn)定斑塊的生成、破裂和血栓形成，始終都有各種炎癥細(xì)胞和大量炎癥介質(zhì)參與，AS的各種改變可認(rèn)為是慢性炎癥的不同階段，各種細(xì)胞反應(yīng)本質(zhì)上與炎癥過程相似，同屬于機(jī)體對損傷的 種反應(yīng)[47, 48]。動脈粥樣硬化斑塊具有許多炎癥反應(yīng)激活的特征，包括單核細(xì)胞進(jìn)入血管壁并被激活，內(nèi)皮細(xì)胞激活，細(xì)胞因子和趨化因子等促炎介質(zhì)上調(diào)[49-52]。其中單核細(xì)胞進(jìn)入血管壁已被視為AS發(fā)生的關(guān)鍵步驟

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