【摘要】：電刺激是一種有效調(diào)制細(xì)胞和組織(包括骨組織)生長行為的手段,如在植入體表面構(gòu)建具有電刺激功能的生物活性涂層,則對植入體建立長期、有效地調(diào)制細(xì)胞生長/組織重建行為和抗菌效能具有重要的意義。本文以構(gòu)建電刺激功能性涂層為遠(yuǎn)期目標(biāo),采用平面微電極,通過強(qiáng)作用于表面附著細(xì)胞的界面局域電刺激模式,并以電極作用于細(xì)胞的源頭為切入點,系統(tǒng)地開展了界面局域電刺激模式對骨細(xì)胞成骨分化影響和作用機(jī)制的研究。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1、電刺激細(xì)胞裝置構(gòu)建分別采用粘觸式和壓觸式,研究了電刺激細(xì)胞培養(yǎng)裝置中導(dǎo)線及電極連接方式的可重復(fù)性和細(xì)胞安全性。通過“銀漿/環(huán)氧樹脂”的封觸式方式,將銅導(dǎo)線與平面微電極相連接。結(jié)果表明:在較高電壓刺激時(1-1.5V),在電極表面有銅元素存在,說明銅線會被電化學(xué)腐蝕。而此過程也使得蛋白在電極正、負(fù)極和中間區(qū)域上吸附效果差異明顯。同時在較長時間置于培養(yǎng)基中刺激時,封觸點會脫落。采用壓觸式方式,設(shè)計了聚四氟乙烯電刺激細(xì)胞培養(yǎng)盒,將化學(xué)穩(wěn)定的鉑(Pt)導(dǎo)線牢固地固定于電極表面,并將導(dǎo)線置于模具內(nèi)部,有效地防止導(dǎo)線產(chǎn)生電化學(xué)腐蝕現(xiàn)象。其電刺激細(xì)胞培養(yǎng)盒能可靠地保障電刺激細(xì)胞實驗的開展。2、適合界面局域電刺激的平面微電極制備電極對外作用強(qiáng)度取決于電極表面的注入電荷量(Qinj),而其與電極材料電荷注入容量(CQ)的特性密切相關(guān),即電極CQ越高,在相同施加電壓下其Qinj也越大。對金(Au)、氧化錫銦(ITO)和聚吡咯(Ppy)三種平面微電極表面的注入電荷容量測定表明,Ppy分別是Au和ITO的24和12倍,Ppy電極顯示出適合作為產(chǎn)生界面局域電刺激模式的電極。在電致聚合方法制備Ppy平面微電極中,通過調(diào)節(jié)沉積電流密度,改變Ppy聚合/沉積動力學(xué)過程,實現(xiàn)對Ppy電極特性調(diào)控。實驗結(jié)果表明:隨著沉積電流密度的增大(3、5和8mA/cm2),Ppy聚合/沉積過程增強(qiáng),Ppy厚度分別為20、50和80 nm。電化學(xué)測定顯示其厚度變化可改變Ppy電極的注入電荷能力(CQ),CQ隨厚度增加而增大。細(xì)胞培養(yǎng)實驗表明Ppy電極具有良好的生物相容性。因此,合理地選擇Ppy沉積條件,可優(yōu)化電極表面對外作用能力,進(jìn)一步強(qiáng)化界面局域電刺激的潛能。3、界面局域電刺激對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響Ppy平面微電極對在表面附著的前成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)作用結(jié)果顯示:在電極上只需施加1 mV就可以有效促進(jìn)細(xì)胞成骨分化,而ITO電極則需施加250 mV,說明本研究的Ppy電極對細(xì)胞可以很好地發(fā)揮界面局域電刺激模式。綜合不同CQ的Ppy電極對細(xì)胞作用結(jié)果,發(fā)現(xiàn)其電極刺激強(qiáng)度Qinj對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化影響行為呈拋物線特征,不同Ppy電極均在Qinj為0.08-0.15 μC時呈現(xiàn)顯著增強(qiáng)細(xì)胞成骨分化效能;高CQ的Ppy電極(Ppy-III),施加1 mV,Qinj就可達(dá)0.08 μC。揭示了界面局域電刺激對細(xì)胞的作用程度不直接依賴于施加的電壓,而以材料特性相關(guān)的電極Qinj為關(guān)鍵參量。此外,刺激強(qiáng)度脈沖頻率上,1或25 Hz的電刺激時顯示可產(chǎn)生增強(qiáng)細(xì)胞成骨分化作用,而50 Hz的刺激則沒有顯示其效能;在刺激時間上,每天刺激時間為0.5、1和24 h/d時,1h/d刺激細(xì)胞可明顯上調(diào)細(xì)胞的ALP蛋白和成骨相關(guān)基因的表達(dá);而在刺激時機(jī)上,發(fā)現(xiàn)界面局域電刺激引發(fā)的成骨分化潛能與細(xì)胞生長階段有關(guān),在8 d細(xì)胞培養(yǎng)的早期(第2-5 d)進(jìn)行的電刺激對于促進(jìn)成骨分化的促進(jìn)作用比對后期(第6-8 d)強(qiáng)。4、界面局域電刺激機(jī)理分析細(xì)胞膜電壓門控被認(rèn)為是電刺激細(xì)胞作用關(guān)鍵點,依據(jù)其種類和特性,結(jié)合本實驗中電極電場分布特點,以及電刺激強(qiáng)度Qinj與細(xì)胞成骨分化響應(yīng)的關(guān)系,揭示了界面局域電刺激機(jī)理特征為:電極Qinj產(chǎn)生的電場主要作用于界面處的細(xì)胞膜,且電場方向平行于細(xì)胞膜,強(qiáng)化胞內(nèi)外離子遷移差異性,從而在很低電壓下即可有效改變膜電位,開啟細(xì)胞膜的L-型電壓門控鈣離子通道,激活細(xì)胞成骨分化通路。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R318
【圖文】：

場傳輸電信號／脈沖［３］。報道指出，體內(nèi)內(nèi)源性電場可通過離子物質(zhì)和大分子的運逡逑輸、膜電壓和細(xì)胞分裂軸以控制器官不對稱來調(diào)節(jié)生物學(xué)過程［４】。逡逑圖１．１給出了生物體內(nèi)四個層次上存在的生物電，分別為細(xì)胞器水平的核膜逡逑在細(xì)胞膜上的電位；細(xì)胞水平上細(xì)胞膜電位維持膜中離子通道和泵的功能；組織逡逑水平上形成俎織的細(xì)胞驅(qū)動跨上皮電位，從而產(chǎn)生電場；在器官水平上局部和長逡逑程特性的組合導(dǎo)致整個解剖學(xué)軸線上的梯度。逡逑Ｏｒｇａｎｅｌｌｅ邋ｌｅｖｅｌ邐Ｂ邋Ｃｅｌｌ邋ｌｅｖｅｌ逡逑Ｎｕｃｌｅａｒ邋ｅｎｖｅｌｏｐｅ邋ｐｏｔｅｎｔｉａｌ邐Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｐｏｔｅｎｔｉａｌ逡逑Ｎｕｃｌｅａｒ逡逑暴邋！邋＃逡逑Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ逡逑ｆｉｌａｍｅｎｔｓ逡逑Ｃ＊邋Ｔｉｓｓｕｅ邋ｌｅｖｅｌ邐Ｊ）邋Ｏｒｇａｎｉｓｍ邋ｌｅｖｅｌ逡逑Ｗｏｕｎｄ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ：邋ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｐｏｔｅｎｔｉａｌ邐Ｗｈｏｌｅ邋ａｎｉｍａｌ邋（ｏｒ邋ａｐｐｅｎｄａｇｅ）：邋ｍａｊｏｒ邋ｂｏｄｙ邋ａｘｅｓ逡逑ｗ邐ｋ邋Ｔｔｇｈｔ邋（ｕｎｃｔｔｏｏｆ逡逑－＂＾ｗ邋．：邋－逡逑圖１．１內(nèi)源性生物電特性。（Ａ）細(xì)胞器水平（如核膜）在細(xì)胞膜上的電位。（Ｂ）細(xì)胞膜電逡逑位維持膜中離子通道和泵的功能。（Ｃ）形成組織的細(xì)胞驅(qū)動跨上皮電位

稱為三螺旋［９］。肢原纖維主要表現(xiàn)為剪切壓電材料，并且在其軸向方向上具有單逡逑軸極化作用［４］。逡逑圖１．４邋Ａ顯示了單根膠原纖維（直徑６５邋ｒａｎ）在金涂覆的硅（Ｓｉ）基板上的逡逑原子力顯微鏡（ＡＦＭ）圖像的高分辨率橫向壓電力顯微鏡（ＰＦＭ）圖像（圖１．４逡逑３逡逑

尖端和樣品下方的基板之間的ＡＣ偏壓施加電場穿過樣品，導(dǎo)致壓電材料變形。逡逑接觸的ＡＦＭ尖端檢測到變形，隨后轉(zhuǎn)換為壓電響應(yīng)的振幅。在橫向模式下，ＡＦＭ逡逑尖端的扭轉(zhuǎn)表現(xiàn)出疇的剪切變形。較小的掃描尺寸圖像如圖１．４邋Ｃ和圖１．４邋Ｄ所逡逑示。橫向ＰＦＭ圖像清楚地區(qū)分了膠原纖維與基底背景，表明在肢原纖維中存在逡逑剪切壓電響應(yīng)。此外，存在對于膠原纖維內(nèi)的重疊和間隙區(qū)域的周期性改變相關(guān)逡逑的壓電響應(yīng)振幅的周期性調(diào)制。測量到具有較大壓電響應(yīng)幅度（在圖像中具有較逡逑亮對比度）的區(qū)域為３０邋ｎｍ寬（對應(yīng)于重疊區(qū)域）和其他具有較小振幅４０邋ｎｍ邋（對逡逑應(yīng)于間隙區(qū)域）的區(qū)域［１（）］。膠原纖維沿纖維軸的橫向壓電響應(yīng)和可忽略的垂直和逡逑徑向壓電響應(yīng)，說明沿膠原纖維軸的單向極化。逡逑＝｜ＱＢ逡逑圖１．４高分辨率壓電力顯微鏡圖像顯示單個膠原纖維中的壓電不均R�。（Ａ）哉V鶩扛駁膩義希櫻楸礱嬪舷允局本段叮靛澹睿淼慕涸宋男蚊餐枷�；（n校疲脫溝縵煊φ穹枷�，显示间辶x舷逗橢氐蛑醒溝縵煊Φ謀浠�；Ｃ和Ｄ以介e〉納璩嘰緇竦玫南嚶π蚊埠停校疲頭

本文編號：2771439