【摘要】：背景：黃斑是人類視覺最敏銳,最關(guān)鍵的部位,視網(wǎng)膜靜脈阻塞、糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜血管炎等繼發(fā)的黃斑水腫,中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、濕性老年性黃斑病變、病理性近視等發(fā)生黃斑脈絡(luò)膜新生血管形成(choroidal neovascularization, CNV)等,是許多嚴(yán)重致盲性眼底疾病的基本病理改變,可造成嚴(yán)重的視力喪失,且與之相關(guān)的眼底病變眾多,發(fā)病呈上升趨勢(shì),但目前尚缺乏有效防治設(shè)施和手段,給社會(huì)和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。1961年,視網(wǎng)膜激光光凝器在激光發(fā)明僅一年時(shí)間之后問世,為眼底疾病的治療帶來革命性的改變,許多眼底病最終只能通過激光治療來控制或延緩病情的發(fā)展,目前激光已成為眼科臨床強(qiáng)有力的治療手段,為此挽救了無數(shù)眼底病患者的視力。隨著激光技術(shù)應(yīng)用的不斷深入,臨床醫(yī)生在應(yīng)用激光治療眼底病的同時(shí)也逐漸認(rèn)識(shí)到其對(duì)眼底組織的破壞作用。一直以來,我們普遍接受一種觀點(diǎn)：當(dāng)激光輻射至眼底時(shí),眼內(nèi)色素組織如(黑色素、血紅蛋白、葉黃素等)將大部分激光能量吸收并將其轉(zhuǎn)變?yōu)闊崃�。大約經(jīng)過lms后,熱量開始向附近組織擴(kuò)散,引起鄰近組織溫度上升。當(dāng)組織局部溫度超過基礎(chǔ)體溫的20-30℃時(shí),將引起周圍組織蛋白質(zhì)的變性,細(xì)胞部分或者完全失去活性,光凝靶組織顏色變白或者發(fā)灰,即形成所謂的光斑。光凝斑對(duì)組織造成的損傷可以是暫時(shí)的或永久的,而且進(jìn)展緩慢。傳統(tǒng)激光治療眼底病時(shí)光凝可破壞掉高耗氧的光感受器細(xì)胞及RPE細(xì)胞,減少代謝需求,改變視網(wǎng)膜缺氧狀態(tài),增加眼球內(nèi)的氧張力和改善包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在內(nèi)的血管因子的產(chǎn)量。然而,這種閾值上視網(wǎng)膜光凝帶來視網(wǎng)膜的損傷及引發(fā)的炎癥反應(yīng)增加了治療的風(fēng)險(xiǎn)及副作用,雖然與不進(jìn)行治療相比,閾值上光凝有確切的好處,但是激光治療獲益的同時(shí)也伴隨著嚴(yán)重的光感受器和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的破壞,以及治療時(shí)產(chǎn)生炎癥,導(dǎo)致視網(wǎng)膜前和視網(wǎng)膜下纖維化,激光瘢痕可在光凝后擴(kuò)大,中心視力可能退化,并有可能發(fā)生脈絡(luò)膜新血管形成,出血,視網(wǎng)膜外層纖維化以及周邊視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜脫離,并可導(dǎo)致視覺敏銳度的下降,視野的縮小,色覺、夜間視力以及對(duì)比敏感度的下降。由于不小心造成的黃斑中心凹光凝可造成視力的早期或者晚期喪失。由此可見,激光導(dǎo)致的視網(wǎng)膜損傷,限制了它的治療密度及可重復(fù)性,同時(shí)限制了治療黃斑中心凹及中心凹附近病變的安全性,而黃斑水腫導(dǎo)致黃斑病變是眾多眼底病最常引起視力下降的原因。最近部分學(xué)者提出新的假設(shè)：視網(wǎng)膜光凝可能通過有功能視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平的上調(diào)或者下調(diào)來發(fā)揮治療效應(yīng)。這也提示了治療的效應(yīng)可能是通過非損傷的RPE細(xì)胞來發(fā)揮效應(yīng),治療視網(wǎng)膜血管病時(shí)帶來的視網(wǎng)膜損傷也許沒有必要。實(shí)際上,不管運(yùn)用何種激光類型或者激光在哪層眼底組織吸收,在修復(fù)血-視網(wǎng)膜屏障過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的是RPE細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)以C57BL/6小鼠視RPE細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?將810nm半導(dǎo)體激光作為光源對(duì)C57BL/6小鼠RPE細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),觀察不同負(fù)載系數(shù)、不同功率的半導(dǎo)體激光作用小鼠RPE細(xì)胞后,RPE細(xì)胞活性及促血管生長(zhǎng)因子：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGF-A)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子beta(TGF-β)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)及抑血管生長(zhǎng)因子：色素上皮源性因子(PEDF)分泌水平的變化,研究810nm半導(dǎo)體激光閾值下不同負(fù)載系數(shù)、不同功率半導(dǎo)體激光對(duì)RPE細(xì)胞凋亡的影響,從而為黃斑區(qū)病變的激光治療增添新的思路。方法：1、細(xì)胞培養(yǎng)：采用一步酶消化法分離獲取小鼠RPE細(xì)胞。RPE細(xì)胞在含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)基中于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),以生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞分裂時(shí)間等指標(biāo)觀察細(xì)胞生存活力及增殖狀態(tài);以光鏡、免疫組織熒光法鑒定RPE細(xì)胞,取第三代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2、選擇合適的激光負(fù)載系數(shù),使得激光在此種負(fù)載系數(shù)下對(duì)RPE細(xì)胞的損傷最�。菏紫�,RPE先隨機(jī)分成兩組(L組及H組),L組激光負(fù)載系數(shù)為5%,H組為10%。兩組共同的激光參數(shù)如下：激光直徑：75μm,功率：100 mW、200 mW、300 mW及400mW,包絡(luò)時(shí)間l00ms。激光干預(yù)前后24小時(shí),RPE細(xì)胞培養(yǎng)液不加胎牛血清。激光干預(yù)RPE細(xì)胞24小時(shí)后,行MTT比色法測(cè)定測(cè)定每孔吸光度值(OD值),并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率%=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。3、Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RPE細(xì)胞凋亡率：根據(jù)MTT結(jié)果選擇對(duì)細(xì)胞損傷作用較小的負(fù)載系數(shù)為5%的激光作為光源,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RPE細(xì)胞,按分組予以不同處理因素：O組(負(fù)載系數(shù)=5%,激光光斑=75μm,包絡(luò)時(shí)間=100ms,功率=0mW),P組(負(fù)載系數(shù)=5%,激光光斑=75μm,包絡(luò)時(shí)間=100ms,功率=100mW),Q組(負(fù)載系數(shù)=5%,激光光斑=75μm,包絡(luò)時(shí)間=100ms,功率=200mW),R組(負(fù)載系數(shù)=5%,激光光斑=75μm,包絡(luò)時(shí)間=100ms,功率=300mW)and S組(負(fù)載系數(shù)=5%,激光光斑=75μm,包絡(luò)時(shí)間=l00ms,功率=400mW),作用24h,進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè),用Cell Quest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。認(rèn)為Annexin V-FITC+PI+和Annexin V-FITC+PI為凋亡細(xì)胞,每次計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞,計(jì)算凋亡率。4、Western blot法測(cè)定RPE細(xì)胞VEGF-A, TGF-p,bFGF,PEDF蛋白表達(dá)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,以0組(負(fù)載系數(shù)=5%,激光光斑=75μm,包絡(luò)時(shí)間=100ms,功率=0mW),P組(負(fù)載系數(shù)=5%,激光光斑=75μm,包絡(luò)時(shí)間=100ms,功率=100mW),Q組(負(fù)載系數(shù)=5%,激光光斑=75μm,包絡(luò)時(shí)間=l00ms,功率=200mW),R組(負(fù)載系數(shù)=5%,激光光斑=75μm,包絡(luò)時(shí)間=100ms,功率=300mW)and S組(負(fù)載系數(shù)=5%,激光光斑=75μm,包絡(luò)時(shí)間=100ms,功率=400mW),以等量DMEM/F12培養(yǎng)基為空白對(duì)照,作用24小時(shí)后,行western blot法測(cè)定各組細(xì)胞VEGF-A, TGF-β, bFGF, PEDF表達(dá),以β-Actin作為內(nèi)參照,用AlphaEase FC軟件分析,測(cè)定各組靶蛋白及內(nèi)參照蛋白的灰度值,以同一樣品中目的蛋白與內(nèi)參灰度值的比值作為蛋白的相對(duì)含量。5、RT-PCR法測(cè)定RPE細(xì)胞VEGF-A, TGF-p, bFGF, PEDF的nRNA表達(dá)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,以0組(負(fù)載系數(shù)=5%,激光光斑=75μm,包絡(luò)時(shí)間=100ms,功率=0mW),P組(負(fù)載系數(shù)=5%,激光光斑=75μm,包絡(luò)時(shí)間=100ms,功率=100mW),Q組(負(fù)載系數(shù)=5%,激光光斑=75μm,包絡(luò)時(shí)間=100ms,功率=200mW),R組(負(fù)載系數(shù)=5%,激光光斑=75μm,包絡(luò)時(shí)間=100ms,功率=300mW)and S組(負(fù)載系數(shù)=5%,激光光斑=751μm,包絡(luò)時(shí)間=100ms,功率=400mW),以等量DMEM/F12培養(yǎng)基為空白對(duì)照,運(yùn)用激光干預(yù)RPE細(xì)胞24小時(shí)后,我們通過RT-PCR及2-△△CT法檢測(cè)分析VEGF-A, TGF-p, b FGF和PEDF的基因相對(duì)表達(dá)量,P-actin設(shè)為內(nèi)參。6、統(tǒng)計(jì)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件分析,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用q檢驗(yàn),以P0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1、倒置相差顯微鏡下RPE細(xì)胞形態(tài)變化：初分離的的黑色、圓形RPE細(xì)胞在1d后開始貼壁,3d后可見淡黑色、短梭形的RPE細(xì)胞且細(xì)胞數(shù)量較前成倍增多,5d后細(xì)胞約80%單層融合長(zhǎng)滿瓶底,7d后細(xì)胞基本單層融合長(zhǎng)滿瓶底,呈典型的鵝卵石鋪地樣。1：2傳代的細(xì)胞生長(zhǎng)活躍、胞核透明、胞漿含豐富黑色顆粒,2-3d后達(dá)融合狀態(tài),細(xì)胞呈梭形及不規(guī)則形。Keratin免疫熒光鑒定顯示所獲細(xì)胞是色素上皮源性細(xì)胞,且細(xì)胞純度接近99%。2、激光在5%負(fù)載系數(shù)模式下對(duì)RPE細(xì)胞活性抑制作用更�。篗TT法分別檢測(cè)不同功率下5%負(fù)載系數(shù)及10%負(fù)載系數(shù)激光對(duì)RPE細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,結(jié)果顯示激光(負(fù)載系數(shù)5%及10%)照射24小時(shí)后,細(xì)胞活性以負(fù)載系數(shù)依賴及能量依賴模式受到抑制,然而,激光在5%負(fù)載系數(shù)模式下對(duì)RPE細(xì)胞活性抑制作用更小(P0.05),且在5%負(fù)載系數(shù),能量為100mW及200mW時(shí),細(xì)胞活性不受抑制(P0.05)。3、激光在5%負(fù)載系數(shù)模式下誘導(dǎo)更少的RPE細(xì)胞凋亡率：行Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)5%負(fù)載系數(shù)激光在不同功率下RPE細(xì)胞的凋亡率,結(jié)果顯示：O組(功率=0mW)細(xì)胞凋亡率為(3.68±0.27)%,P組(功率=100mW)細(xì)胞凋亡率為(3.52±0.36)%,Q組(功率=200mW)細(xì)胞凋亡率為(3.58±0.29)%,R組(功率=300mW)細(xì)胞凋亡率為(9.31±0.59)%、S組(功率=400mW)細(xì)胞凋亡率為(14.24±0.45)%,R組(功率=300mW)、S組(功率=400mW)凋亡率顯著提高,存在顯著性差異(P0.05),激光設(shè)置在5%負(fù)載系數(shù),功率為100mW及200mW時(shí),細(xì)胞凋亡率最低且與對(duì)照組O組(功率=0mW)一致(P0.05)。4、激光在5%負(fù)載系數(shù)模式下誘導(dǎo)RPE細(xì)胞VEGF-A, TGF-β, b FGF和PEDF蛋白的表達(dá)：Western blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,激光干預(yù)24小時(shí)后,各個(gè)功率組促血管生長(zhǎng)因子(VEGF-A, TGF-β and b FGF)表達(dá)下調(diào)(*P0.05),抑血管生長(zhǎng)因子(PEDF)表達(dá)上調(diào)(*P0.05),實(shí)驗(yàn)組之間因子水平的改變沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。5、激光在5%負(fù)載系數(shù)模式下誘導(dǎo)RPE細(xì)胞VEGF-A, TGF-β, b FGF和PEDF基因的表達(dá)：RT-PCR結(jié)果顯示：與Western blot法檢測(cè)結(jié)果相一致,與對(duì)照組相比,激光干預(yù)24小時(shí)后,各個(gè)功率組抑血管生長(zhǎng)因子(VEGF-A, TGF-β and b FGF)基因相對(duì)表達(dá)下調(diào)(*P0.05),促血管生長(zhǎng)因子(PEDF)基因相對(duì)表達(dá)上調(diào)(*P0.05)。實(shí)驗(yàn)組之間因子水平的改變沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論：我們的結(jié)果顯示：與10%負(fù)載系數(shù)的工作模式相比,810nm半導(dǎo)體激光在5%負(fù)載系數(shù)的工作模式下對(duì)RPE細(xì)胞活性抑制作用更小,甚至在5%負(fù)載系數(shù),功率=100mW與200mW工作模式時(shí),810nm半導(dǎo)體激光誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞凋亡率與空白對(duì)照組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,同時(shí)可引起血管抑制生長(zhǎng)因子(PEDF)的高表達(dá),而抑制促血管生長(zhǎng)因子(VEGF-A, TGF-β及bFGF)水平的表達(dá)。這提示了通過控制負(fù)載系數(shù)及功率,微脈沖閡值下激光有望實(shí)現(xiàn)視網(wǎng)膜血管疾病的閾值下光療。當(dāng)然體內(nèi)細(xì)胞因子相互作用網(wǎng)絡(luò)很復(fù)雜,CNV形成機(jī)制仍在研究,微脈沖閾值下半導(dǎo)體激光是否能通過對(duì)RPE閾值下照射來治療CNV,以及作用機(jī)制仍需要更多的體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證和研究探討。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R779.63
【圖文】：
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【共引文獻(xiàn)】
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本文編號(hào)：
2765997
