【摘要】：當(dāng)人體自身的組織、器官因外傷或者疾病而產(chǎn)生損傷和功能性喪失時(shí),會對人類的健康及生命安全產(chǎn)生嚴(yán)重的威脅。病變組織和器官的及時(shí)修復(fù)以及功能恢復(fù)則成為治療疾病的重要環(huán)節(jié)。在現(xiàn)有的醫(yī)學(xué)認(rèn)知條件下,根據(jù)病變部位的損傷程度對受損部位進(jìn)行修補(bǔ),或者借助自體、異體移植以及人工器官對其進(jìn)行置換和重建,或許是最好的解決辦法。然而,目前仍有許多重大科學(xué)問題亟待解決,這些問題可以歸納為以下兩方面。其一,自愿捐獻(xiàn)的供體器官數(shù)量明顯不足,難以滿足臨床需求;其二,通過人工手段開發(fā)的人工組織、器官與人體組織的同源性差、結(jié)構(gòu)差異大,很難兼具良好的生物相容性和機(jī)械性能。因此,最大限度地提高人工生物材料的生物相容性并縮短生物材料的開發(fā)周期,是提高人工組織、器官臨床應(yīng)用成功的必要環(huán)節(jié)和重要保障。目前,對生物材料的生物相容性評價(jià)多采用體外評價(jià)和體內(nèi)評價(jià)。體外評價(jià)以通過體外建立的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ),對材料與細(xì)胞或血液的相容性進(jìn)行評價(jià);體內(nèi)評價(jià)是直接將材料植入實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)對材料與組織是否相容進(jìn)行評價(jià)。相較于動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn),體外評價(jià)更為方便、快捷,可以節(jié)約大量的時(shí)間、金錢和人力,已廣泛用于紡織生物材料的設(shè)計(jì)及性能預(yù)估。但是,目前的體外評價(jià)手段具有一定的局限性。首先,定性分析需要通過定量分析來佐證;其次,這兩種方法均存在一個致命的缺陷,即難以揭示細(xì)胞生長的內(nèi)在因素及調(diào)控機(jī)制。因此,在體外評價(jià)體系中,引入一個既能反映細(xì)胞生長狀態(tài),又能揭示影響細(xì)胞生長的機(jī)制的合適的指標(biāo)和合理的方法,具有重要意義。針對目前生物相容性體外評價(jià)所存在的缺陷,本課題以纖維集合體微納結(jié)構(gòu)對細(xì)胞黏附的影響為切入點(diǎn),圍繞以下四個方面進(jìn)行研究。(1)引入細(xì)胞間粘附分子-1(Intercellular cell adhesion molecular-1,ICAM-1)作為評價(jià)指標(biāo),揭示材料結(jié)構(gòu)與細(xì)胞黏附之間的調(diào)控機(jī)制。通過選用不同孔徑的篩網(wǎng)以控制發(fā)泡劑的尺寸,制備孔徑分布為0-38μm、38-75μm、75-100μm的PCL多孔膜,測定其水接觸角,評價(jià)不同孔徑分布對材料親疏水性的影響。隨之,將材料與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)進(jìn)行共同培養(yǎng),分別使用免疫熒光、免疫酶標(biāo)技術(shù)(ELISA)檢測孔徑大小及其分布是否影響細(xì)胞膜表面胞間粘附分子(Membrane ICAM-1,mICAM-1)、可溶性粘附分子(SolubleICAM-1,sICAM-1)的表達(dá),分析不同孔徑分布的材料表面,細(xì)胞表達(dá)mICAM-1與sICAM-1之間的關(guān)系,探究其作為新的指標(biāo)評價(jià)細(xì)胞在材料表面黏附狀態(tài)的可行性、可靠性及準(zhǔn)確性。(2)通過均質(zhì)微孔機(jī)織平紋結(jié)構(gòu)的構(gòu)建,深入研究不同微米級孔徑結(jié)構(gòu)與細(xì)胞生長特性的構(gòu)效關(guān)系并選擇最優(yōu)結(jié)構(gòu)。選取30 D滌綸單絲和復(fù)絲作為基礎(chǔ)材料,選取30 D滌綸單絲為經(jīng)紗,控制經(jīng)紗密度為850根/10厘米不變,選用30 D的滌綸單絲或復(fù)絲作為緯紗并改變緯紗密度(單絲600、700和800根/10厘米,復(fù)絲500、600和700根/10厘米),織造具有不同微米級孔徑尺寸的滌綸平紋機(jī)織結(jié)構(gòu);表征材料表面的孔隙率、緊度和親疏水性;通過CCK-8、掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡、ICAM-1表達(dá)評價(jià)其對細(xì)胞細(xì)胞生長特性的影響,優(yōu)選最適宜細(xì)胞黏附和增殖的機(jī)織結(jié)構(gòu)及相應(yīng)的微米級孔徑。(3)探究機(jī)織結(jié)構(gòu)由低溫等離子刻蝕處理形成表面具有納米溝槽的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),研究其表面納米結(jié)構(gòu)變化對細(xì)胞糖組的影響。選用氬氣,在20 Pa的真空度下處理5min,改變刻蝕功率(150 W、200 W、250 W和300 W),對滌綸平紋織物進(jìn)行低溫等離子體刻蝕,在單絲表面構(gòu)建了四種不同的納米級溝槽結(jié)構(gòu)。使用CCK-8、掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡,檢測黏附在材料表面的細(xì)胞活性和生長狀態(tài),免疫熒光、ELISA法檢測細(xì)胞mICAM-1及sICAM-1的表達(dá)水平,評價(jià)機(jī)織結(jié)構(gòu)表面的納米級拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對細(xì)胞相容性的影響;并將最新的細(xì)胞O-糖鏈擴(kuò)增技術(shù)(Cellular O-Glycome Reporter/Amplification,CORA)、蛋白質(zhì)印跡法(WesternBlot)、膠內(nèi)酶解以及質(zhì)譜分析引入生物材料的細(xì)胞相容性評價(jià)體系,通過材料微納結(jié)構(gòu)對N-聚糖和O-聚糖表達(dá)的影響,即細(xì)胞糖組變化揭示其對細(xì)胞生長的調(diào)控機(jī)制。(4)初步探索在不同流速下,內(nèi)皮細(xì)胞在不同微納結(jié)構(gòu)表面的黏附力強(qiáng)弱,以及在動態(tài)培養(yǎng)條件下細(xì)胞在材料表面黏附力與流體剪切力之間的關(guān)系。利用體外循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng),通過控制體系內(nèi)流體的流速(1 m/s,2 m/s和3 m/s),檢測并分析流體對材料表面黏附細(xì)胞進(jìn)行沖刷后,單位面積材料表面剩余黏附細(xì)胞與流體剪切力的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:(1)在一定范圍內(nèi)(0-100 μm),PCL多孔膜表面親水性隨孔徑增大而提高。同時(shí),隨多孔膜表面孔徑增大,I型膠原在材料表面的單位面積黏附量也相應(yīng)增加;孔徑分布不但影響材料表面的親疏水性,也影響細(xì)胞外基質(zhì)在材料表面的黏附以及細(xì)胞在材料表面的黏附和增殖。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在微孔直徑為0-38 μm的PCL膜表面生長7天可形成單細(xì)胞內(nèi)皮層,在直徑為38-75 μm的PCL膜表面細(xì)胞覆蓋面積為60%,在直徑75-100 μm的PCL膜表面細(xì)胞覆蓋面積為80%。ICAM-I表達(dá)水平,可以作為評價(jià)細(xì)胞與材料黏附及材料生物相容性的一個重要指標(biāo);mICAM-1升高細(xì)胞在材料表面的黏附及增殖能力較強(qiáng);sICAM-1升高細(xì)胞在材料表面的黏附及增殖能力受抑。(2)控制經(jīng)紗種類為單絲并保持經(jīng)紗密度不變,僅改變緯紗密度及選用單絲或復(fù)絲作為緯紗,成功構(gòu)建了六種具有不同孔隙率和緊度的機(jī)織平紋結(jié)構(gòu),其水接觸角均在30°-45°以內(nèi),化學(xué)結(jié)構(gòu)無明顯差異。當(dāng)緯紗為單絲時(shí),隨緯紗密度增加,親水性提高;當(dāng)緯紗為復(fù)絲時(shí),隨緯紗密度增加,親水性減弱;細(xì)胞在緯紗為復(fù)絲的表面黏附情況優(yōu)于單絲,這是因?yàn)閺?fù)絲表面存在天然的平行溝槽結(jié)構(gòu),且組織點(diǎn)處的復(fù)絲表面較為平整,細(xì)胞可以附著的位點(diǎn)較多。細(xì)胞在機(jī)織微孔材料表面的初始黏附多集中在組織點(diǎn)處,組織點(diǎn)處孔徑尺寸越小,mICAM-1水平越高,sICAM-1濃度越低。設(shè)計(jì)密度為經(jīng)密(單紗)×緯密(復(fù)絲)為850×700根/10厘米的結(jié)構(gòu),其孔徑尺寸小于20 μm時(shí)有助于細(xì)胞在材料表面內(nèi)皮化進(jìn)程,確定為本實(shí)驗(yàn)最優(yōu)結(jié)構(gòu)。(3)選用氬氣等離子體對優(yōu)選后的機(jī)織滌綸平紋材料(A:850×700根/10厘米)進(jìn)行刻蝕,經(jīng)過等離子體刻蝕后,在材料C(200 W)、D(250 W)和E(300 W)表面均出現(xiàn)了相對明顯的溝槽結(jié)構(gòu),溝槽寬度分別為 294.20 ± 0.08 nm、523.63 ± 0.14 nm 和 785.07 ± 0.21 nm,而在材料B表面的單絲上,僅發(fā)現(xiàn)少量不規(guī)則的細(xì)紋,說明溝槽的存在對于該種O-聚糖結(jié)構(gòu)的表達(dá)起到了一定的促進(jìn)作用。與未處理前相比,具有微納溝槽結(jié)構(gòu)的材料表面細(xì)胞sICAM-1的水平明顯降低,有助于細(xì)胞黏附。與空白對照相比,未經(jīng)等離子體處理的材料表面細(xì)胞 Core1(955、1003Da)、Core2(1317、1404、1766Da)結(jié)構(gòu)的表達(dá)均有降低,N-聚糖結(jié)構(gòu)未見明顯改變。等離子體處理不能影響材料表面細(xì)胞N-聚糖表達(dá),但可不同程度地影響材料表面細(xì)胞O-聚糖表達(dá);B表面的細(xì)紋結(jié)構(gòu)只能升高細(xì)胞Core1(1003 Da)及Core2(1404Da)結(jié)構(gòu)表達(dá)水平;具有微納溝槽結(jié)構(gòu)表面的C、D和E材料可使Core 1及Core 2結(jié)構(gòu)增高。(4)體外動態(tài)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,等離子體刻蝕構(gòu)建的微納溝槽結(jié)構(gòu)可增強(qiáng)細(xì)胞在材料表面的黏附力。當(dāng)材料用于制作人工血管時(shí),可根據(jù)血管壁所受剪切力,依據(jù)不同剪切力作用下,材料表面剩余黏附細(xì)胞數(shù)量來選擇合適的材料。根據(jù)不同等離子體刻蝕功率將實(shí)驗(yàn)材料編號為 A(150W)、B(200W)、C(250W)、D(300W)和 E(未處理試樣),當(dāng)剪切力5.4dyn(體外培養(yǎng)流速為1m/s)部位的選材順序?yàn)镈B=CA=E,剪切力為7.0dyn(體外培養(yǎng)流速為2m/s)部位的選材順序?yàn)镈AC=BE,而剪切力為11.2dyn(體外培養(yǎng)流速為3m/s)部位的選材順序?yàn)镈=ABC=E。綜上所述,本研究通過構(gòu)建具有不同微納拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的機(jī)織平紋表面,不僅證實(shí)了微納拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可影響細(xì)胞黏附,而且成功地將粘附分子引入材料生物相容性的評價(jià)體系;并首次通過探究材料結(jié)構(gòu)對黏附細(xì)胞表面糖組結(jié)構(gòu)表達(dá)的影響,揭示了材料影響內(nèi)皮細(xì)胞黏附的根本原因。在此基礎(chǔ)上,借助體外動態(tài)培養(yǎng),探究了不同流體剪切力對材料表面黏附細(xì)胞的影響,進(jìn)一步完善了體外生物相容性評價(jià)體系,為材料的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)及生物相容性評價(jià)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R318.08
【圖文】：

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本文編號：2764516