【摘要】：樹形高分子是一種高分子聚合物基因載體,分子表面的伯胺基團(tuán)可以高效地濃縮核酸分子,形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；分子內(nèi)部的三級胺具有pH緩沖能力,可以吸收大量的氫質(zhì)子,幫助轉(zhuǎn)染復(fù)合物從內(nèi)涵體中逃逸。但是,樹形高分子的基因轉(zhuǎn)染效率有限,并且分子表面大量的伯胺基團(tuán)會導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞毒性。因此,有必要對樹形高分子進(jìn)行表面功能化修飾,改善樹形高分子的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性。研究表明,在樹形高分子進(jìn)行多種功能化修飾,可以有效提高樹形高分子基因轉(zhuǎn)染效率、降低自身的細(xì)胞毒性。這些修飾的作用主要是調(diào)控樹形高分子的理化性質(zhì),如氨基酸修飾可以調(diào)控表面電荷密度和內(nèi)涵體逃逸能力；脂質(zhì)分子可以調(diào)控親疏水平衡；氟化修飾可以調(diào)控自組裝性能,糖基化和蛋白修飾可以提供靶向能力。然而,大多數(shù)表面功能化修飾對于樹形高分子轉(zhuǎn)染效果的提高有限,細(xì)胞毒性問題也沒有很好地解決,遠(yuǎn)不能勝任基因治療的任務(wù)。所以如何通過新的機(jī)制以樹形高分子為平臺設(shè)計(jì)出高效、低毒、具有基因治療價值的基因運(yùn)輸載體成為研究的難點(diǎn)。本文提出了一種新的表面功能化修飾策略,即在樹形高分子表面共價修飾含有氫鍵供、受體的二氨基三嗪(DAT)基團(tuán),通過氫鍵相互作用調(diào)控樹形高分子的基因轉(zhuǎn)染效率。DAT基團(tuán)能夠(1)與核酸分子中的堿基發(fā)生氫鍵相互作用,輔以樹形高分子表面伯胺基團(tuán)的靜電相互作用協(xié)同結(jié)合核酸分子,形成良好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物；(2)與三聚氰酸(CyA)分子通過多重氫鍵識別將低代數(shù)(G3)樹形高分子自組裝成大分子量基因載體,從而設(shè)計(jì)出高效、低毒、可用于基因治療的基因運(yùn)輸載體。本文的主要研究方法及結(jié)論如下：(1)在高代數(shù)樹形高分子表面共價修飾DAT基團(tuán),制備了具有氫鍵供、受體的基因載體。DAT可以與堿基形成多重互補(bǔ)氫鍵,在與靜電結(jié)合的協(xié)同作用下,能夠在水中將DNA濃縮形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合物,可以有效地保護(hù)DNA免受DNA酶的降解。DAT修飾可以提高轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞攝入,使其在多種細(xì)胞系,如HEK293、COS-7、HO和HeLa細(xì)胞中展現(xiàn)出非常高的基因轉(zhuǎn)染效率,甚至好于商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑bPEI 25KD和Lipofectamine 2000。并且,DAT修飾也賦予了樹形高分子非常好的抗血清能力、細(xì)胞穿透能力、改善的細(xì)胞毒性和極低的溶血能力,使其有望應(yīng)用于基因治療領(lǐng)域。此外,在樹形高分子表面修飾其他氫鍵配體,如堿基衍生物,或?qū)AT基團(tuán)修飾在其他陽離子聚合物上,同樣能夠大幅提高基因載體的基因轉(zhuǎn)染效率,說明這種氫鍵修飾是一種廣泛適用的修飾策略,對于構(gòu)建新型的基因載體具有參考價值。(2)上一部分研究已經(jīng)表明DAT修飾的樹形高分子可以作為高效的基因載體,因此在這一部分中將所制得的基因載體用于基因治療。非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系PC-9中高表達(dá)MDM2蛋白,以MDM2基因?yàn)榘悬c(diǎn),向PC-9細(xì)胞中運(yùn)輸MDM2siRNA,干擾MDM2蛋白表達(dá),可以激活p53信號通路,誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞PC-9凋亡。DAT修飾的樹形高分子基因載體,能夠高效運(yùn)輸MDM2 siRNA,沉默MDM2蛋白的表達(dá),在細(xì)胞水平上能夠高效誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系PC-9的凋亡,其效果好于商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000;在動物水平上,可有效抑制裸鼠模型中PC-9皮下腫瘤的生長。這些結(jié)果證明DAT修飾的樹形高分子不僅可以作為高效的DNA載體,也可以作為高效的siRNA載體。(3)傳統(tǒng)的陽離子聚合物基因載體在轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性之間存在一個惡性關(guān)聯(lián),即分子量越大,轉(zhuǎn)染效率越高,隨之細(xì)胞毒性也越高。而通過可降解的交聯(lián)劑(如含有二硫鍵)構(gòu)建具有生物降解性能的陽離子聚合物可以在提高基因轉(zhuǎn)染效率的同時保持極低的細(xì)胞毒性。然而,這種交聯(lián)方式具有不穩(wěn)定和可控性差等問題,對于基因載體的合成、保存、以及批次與批次之間的一致性都要求非常高。為了解決這個棘手的問題,本章節(jié)通過氫鍵自組裝的方式,以非共價方式構(gòu)筑新型基因載體,即利用CyA分子與DAT基團(tuán)之間多重氫鍵識別進(jìn)行自組裝。在低代數(shù)(G3)樹形高分子表面共價修飾DAT基團(tuán),通過其與CyA之間的多重氫鍵識別自組裝形成具有超分子結(jié)構(gòu)的基因載體。其中,CyA可以輔助濃縮核酸分子,形成更加緊湊的轉(zhuǎn)染復(fù)合物,提高轉(zhuǎn)染復(fù)合物的穩(wěn)定性,保護(hù)DNA免受核酸酶降解；還可以有效提高轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞攝入。在HEK293和COS-7細(xì)胞中,這種超分子基因載體具有高效的基因轉(zhuǎn)染效率,與商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑bPEI25KD相當(dāng)。而且,加入的CyA分子不會增加額外的細(xì)胞毒性。將多重氫鍵識別改為單氫鍵識別(CyA和4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪,DMT)時,不能增加轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞攝入,且基因載體喪失轉(zhuǎn)染效率,說明多重互補(bǔ)氫鍵識別對于超分子基因載體的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染高效性至關(guān)重要。這種氫鍵自組裝策略簡單易行,而且打破了載體分子量—轉(zhuǎn)染效率—細(xì)胞毒性之間的惡性關(guān)聯(lián),實(shí)現(xiàn)了低代數(shù)樹形高分子高效、低毒的基因轉(zhuǎn)染,對于研發(fā)新型基因轉(zhuǎn)染材料意義非凡。簡而言之,本論文利用氫鍵配體分子之間氫鍵識別,或是調(diào)控基因載體與核酸分子之間轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成,或是調(diào)控基因載體的形成,能實(shí)現(xiàn)高效的基因轉(zhuǎn)染與基因治療,并維持較低的細(xì)胞毒性。氫鍵調(diào)控有望發(fā)展成為一種提高樹形高分子基因轉(zhuǎn)染效率的新策略。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;R318
【圖文】：

理想的基因載體，應(yīng)該能夠有效地結(jié)合、包裹核酸物質(zhì)，在體內(nèi)循環(huán)的過程逡逑中保護(hù)核酸免受核酸酶的降解，并且能夠穿越包括細(xì)胞膜在內(nèi)各種生物屏障，將逡逑核酸物質(zhì)輸送到所要發(fā)揮作用的位置（圖１．１）。在近２０年的基因治療臨床試驗(yàn)逡逑中，最主要、最成功的基因載體是病毒載體，主要包括腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢逡逑病毒，治療范圍涵蓋從神經(jīng)性疾病到癌癥等廣泛領(lǐng)域［４］。病毒載體在基因運(yùn)輸中逡逑具有多種優(yōu)勢：能夠在宿主體內(nèi)保持穩(wěn)定，識別潛在的宿主細(xì)胞，體內(nèi)運(yùn)輸效率逡逑高［５］。但是，病毒載體的缺陷也極為明顯，比如目的基因容量比較小，無法大規(guī)逡逑模制備且比較昂貴，更為人訴病的是與身俱來的感染性和寄生性，使其在基因治逡逑１逡逑

現(xiàn)今主流的非病毒基因載體可分為兩種，一種是脂質(zhì)體載體，另一種是高分逡逑子聚合物載體。樹形高分子（Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）是一種人工合成的高分子聚合物，具逡逑有精確層狀結(jié)構(gòu)和尺寸，在溶液中呈球狀或橢球狀（圖１．２）。其名稱來源于希臘逡逑詞匯（Ｄｅｎｄｒｏｎ），即“樹”的意思。通常，樹形高分子由三部分組成，第一個是逡逑處于中央的內(nèi)核部分，作為樹杈結(jié)構(gòu)延生的核心（Ｃｏｒｅ）；第二個是由逐步合成逡逑方法從每一個樹杈節(jié)點(diǎn)延生出來的重復(fù)單元部分，每合成一層，即為一代逡逑（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．邋Ｇ），重復(fù)單元的長短、結(jié)構(gòu)和代數(shù)的多少決定樹形高分子的尺寸、逡逑結(jié)構(gòu)和內(nèi)部空腔；第三個是處于樹形高分子表面的官能基團(tuán)（Ｔｅｒｍｉｎａｌ邋Ｇｒｏｕｐｓ），逡逑它賦予了樹形高分子的表面性質(zhì)，是樹形高分子多共價效應(yīng)的基礎(chǔ)［９］。由于樹形逡逑高分子獨(dú)特的合成方法學(xué)，使得樹形高分子擁有精確的分子量、分子結(jié)構(gòu)和納米逡逑尺寸

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本文編號：2733322