發(fā)布時(shí)間：2020-06-26 17:47

【摘要】：研究目的:(1)改進(jìn)現(xiàn)有生物3D打印流程和生物材料,提高3D打印效率和打印質(zhì)量;(2)探究Alg-Gel生物墨水溶劑PBS的離子強(qiáng)度(或濃度)對(duì)生物墨水可打性和打印組織形態(tài)保持能力的影響;(3)探究Alg-Gel生物墨水溶劑PBS的離子強(qiáng)度(或濃度)對(duì)表皮干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響;(4)探究雙向調(diào)節(jié)Alg-Gel生物墨水溶劑PBS的離子強(qiáng)度和溶質(zhì)明膠的濃度對(duì)表皮干細(xì)胞的干性維持和分化的作用。研究方法:(1)通過檢測不同海藻酸鈉原料樣品的分子量分布,選擇分子量均一、雜質(zhì)含量較少的樣品;通過檢測運(yùn)用不同打印溫度和打印噴頭進(jìn)行打印后的組織中表皮干細(xì)胞的細(xì)胞活性,選擇對(duì)細(xì)胞活性影響較小的打印溫度和噴頭。(2)檢測不同溶劑的Alg-Gel生物墨水的黏度、剪切應(yīng)力、儲(chǔ)能模量以及耗能模量曲線,對(duì)生物墨水進(jìn)行可打性測試,并分析物理性能與可打性的相互關(guān)系;對(duì)不同溶劑Alg-Gel生物墨水的打印組織進(jìn)行體外培養(yǎng),觀察其表面形態(tài)并觀測其形態(tài)保持能力,并分析其與生物墨水機(jī)械性能的相互關(guān)系。(3)運(yùn)用Live/Dead染色檢測不同溶劑的Alg-Gel生物墨水打印組織中表皮干細(xì)胞在體外培養(yǎng)中活細(xì)胞比例的變化;運(yùn)用Ki-67染色檢測表皮干細(xì)胞增殖活性的變化;運(yùn)用免疫熒光染色法和RT-PCR檢測表皮干細(xì)胞表達(dá)角質(zhì)蛋白K5、K14、K8和K18的情況,分析其向汗腺細(xì)胞分化的情況:顯微鏡下觀察對(duì)打印微結(jié)構(gòu)內(nèi)細(xì)胞聚集情況進(jìn)行評(píng)估和分析。(4)運(yùn)用改進(jìn)后的3D打印流程測試不同溶劑離子強(qiáng)度和溶質(zhì)濃度的Alg-Gel生物墨水的可打性,并測量不同打印組織的延展率;運(yùn)用Live/Dead染色檢測生物墨水中活細(xì)胞比例在體外培養(yǎng)過程中的變化;運(yùn)用RT-PCR對(duì)不同生物墨水中表皮干細(xì)胞表達(dá)K5、K14、K8、K18、K10和E-cad的情況進(jìn)行定量分析;運(yùn)用顯微鏡對(duì)打印微結(jié)構(gòu)中細(xì)胞聚集情況進(jìn)行評(píng)估,并結(jié)合細(xì)胞表達(dá)marker的情況對(duì)細(xì)胞增殖和分化的情況進(jìn)行分析。研究結(jié)果:(1)海藻酸鈉樣品C的分子量分布較集中,且實(shí)際打印組織中雜質(zhì)較少;內(nèi)徑≥340 μm的打印噴頭對(duì)細(xì)胞剪切應(yīng)力較小,且對(duì)打印后細(xì)胞活性影響較小,內(nèi)徑340 μm的打印噴頭對(duì)細(xì)胞剪切應(yīng)力明顯增大,且顯著降低了打印后的細(xì)胞活性;打印筒溫度為4℃時(shí),活細(xì)胞比例低于50%;打印筒溫度升至10℃-20℃之間時(shí),活細(xì)胞比例明顯增加;打印筒溫度升至20℃以上時(shí),活細(xì)胞比例基本維持在90%以上。打印平臺(tái)溫度對(duì)細(xì)胞活性影響比打印筒小,相同打印筒溫度下,不同平臺(tái)溫度下細(xì)胞活性不變。(2)從生物墨水B-1到B-4,隨溶劑離子強(qiáng)度的增加,Alg-Gel生物墨水的儲(chǔ)能模量(G')明顯增加,耗能模量(G")明顯減小;同時(shí),黏度(V)明顯減小,剪切應(yīng)力也隨之減小;B-1的表面平坦,表面細(xì)胞伸展;B-2的表面呈現(xiàn)光滑的溝壑狀,細(xì)胞伸展和分支明顯;B-3和B-4表面明顯變得疏松且呈顆粒狀,表面的細(xì)胞不伸展或聚集成細(xì)胞團(tuán)且表面被墨水包裹;在體外培養(yǎng)過程中,B-1和B-2打印組織基本保持了打印形態(tài),透光性好,打印組織中的細(xì)胞清晰可見,而B-3和B-4打印組織明顯膨脹,B-4膨脹更嚴(yán)重,鏡下觀察時(shí)打印組織表面呈絨毛狀,透光性差,細(xì)胞影模糊,并出現(xiàn)了打印材料聚集和散落的現(xiàn)象。(3)3D打印的打印過程對(duì)細(xì)胞活性的影響較小,但隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長,細(xì)胞活性緩慢下降;體外培養(yǎng)過程中,細(xì)胞增殖活性下降明顯,B-1增殖活性降至50%以下,B-2下降趨勢較緩;B-2打印組織中細(xì)胞增殖并聚集成團(tuán)現(xiàn)象比較明顯,且在第14-28天之間,細(xì)胞團(tuán)內(nèi)細(xì)胞影逐漸模糊,部分形成了不規(guī)則扭曲的腺樣結(jié)構(gòu);B-2打印組織中,細(xì)胞持續(xù)表達(dá)K5、K14的同時(shí),K8和K18的表達(dá)也明顯升高。(4)同時(shí)改變Alg-Gel生物墨水的溶質(zhì)明膠濃度和溶劑PBS離子強(qiáng)度,明顯影響了可打性:低濃度明膠+中、高離子強(qiáng)度生物墨水無法完成打印,低濃度明膠+低離子強(qiáng)度以及中濃度明膠+高離子強(qiáng)度生物墨水打印組織的延展率較高,其余生物墨水的打印組織均可以完成打印且延展率較低;改變?nèi)苜|(zhì)和溶劑對(duì)打印組織中細(xì)胞活性沒有影響,主要影響了細(xì)胞的聚集和分化:中、高濃度明膠+中離子強(qiáng)度顯著促進(jìn)了細(xì)胞增殖和聚集,且可以在維持干性的同時(shí)促進(jìn)向汗腺分化,高離子強(qiáng)度墨水中細(xì)胞增殖較弱,但可以穩(wěn)定維持細(xì)胞干性,高濃度明膠+低離子強(qiáng)度墨水中細(xì)胞增殖弱,不能維持干性,但可以促進(jìn)向表皮角質(zhì)細(xì)胞分化。研究結(jié)論:(1)在原有3D打印流程的基礎(chǔ)上,優(yōu)選了打印噴頭(340 μm)、提高了打印溫度(20℃)并篩選了更適合3D打印的海藻酸鈉樣品(C),提高了 3D打印效率和質(zhì)量。(2)初步建立通過改變?nèi)軇㏄BS濃度(或離子強(qiáng)度)調(diào)節(jié)Alg-Gel生物墨水物理性能的方法,溶劑PBS濃度(或離子強(qiáng)度)越高,Alg-Gel生物墨水的黏度和硬度越低,打印組織的形態(tài)保持能力越差,綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,Alg-Gel生物墨水B-2(溶劑為0.5×PBS,離子強(qiáng)度0.082M)不僅具有良好的可打性,而且打印組織的膨脹率和降解率均較低,可以進(jìn)行長期體外培養(yǎng)觀察。(3)探索了 Alg-Gel生物墨水溶劑的改變對(duì)表皮干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。通過排除生物墨水中生物材料的種類、濃度以及溶劑種類的影響,單純改變生物墨水溶劑的離子強(qiáng)度,確定了 Alg-Gel生物墨水B-2的打印組織對(duì)表皮干細(xì)胞的生物學(xué)行為具有明顯的促進(jìn)作用:與其他生物墨水相比,B-2明顯提高了表皮干細(xì)胞的增殖活性,且在維持干性的同時(shí),促進(jìn)其向汗腺細(xì)胞分化,并且在打印組織中形成細(xì)胞聚集的腺樣結(jié)構(gòu)。(4)高濃度明膠(5%)可以促進(jìn)表皮干細(xì)胞向表皮角質(zhì)細(xì)胞分化,較高的離子強(qiáng)度(0.156M)可以維持表皮干細(xì)胞的干性,適中的明膠濃度和離子強(qiáng)度(3%,0.082M)可以在維持表皮干細(xì)胞干性的同時(shí),促進(jìn)其向汗腺細(xì)胞分化。該部分研究為含汗腺3D打印皮膚替代物模型的構(gòu)建提供了充分的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R318.08
【圖文】：

１．２結(jié)果逡逑本研宄以生物３Ｄ打印技術(shù)為基礎(chǔ)，擬研宄生物３Ｄ打印在汗腺再生及皮膚替逡逑代物研發(fā)中的應(yīng)用。如圖１－１邋（Ａ）所示，擠出式生物３Ｄ打印系統(tǒng)目前已廣泛應(yīng)逡逑用于人體多種組織和器官的再生研究。在汗腺再生和皮膚替代物研發(fā)方面，基于逡逑我們實(shí)驗(yàn)小組已有研宄成果，本研宄將遵循如下研究思路，如圖１－１邋（Ｂ）所示：逡逑１．改進(jìn)操作流程以提高打印效率和打印質(zhì)量；２．改進(jìn)生物墨水以適應(yīng)細(xì)胞行為和組逡逑織發(fā)生；３．創(chuàng)新皮膚替代物構(gòu)建方法以適應(yīng)臨床需求。為實(shí)現(xiàn)以上目標(biāo)，我們首先逡逑對(duì)己有的生物３Ｄ打印操作流程進(jìn)行了改進(jìn)，為之后的生物墨水和皮膚替代物模型逡逑研宄奠定了重要的基礎(chǔ)。逡逑■１＾逡逑ｙｊＢＢＢｉｉｉｉ＃＇＇＇邋ｎ邋ＫＨＩＢ逡逑Ｂ逡逑（Ｇｅｌ－Ａ？邐}0＿ｉ邐ｂｉｏｐｒｉｍｉｎｇ邐邐逡逑澯邐｜—R釴．逡逑Ｂｉｏ－ｆａｃ．ｏｒ＊ｒ．：Ｖ邋＂邐Ｔ邐＾逡逑（ＰＤ）邐Ｂｉｏｉｎｋ邐擇孑逡逑Ｉ邋Ｃｕｌａｉｒｅ逡逑？ｕｉｖｉ，ｒｏ逡逑．４■扢．逡逑圖１－１．?dāng)D出式生物３Ｄ打印系統(tǒng)的組成及生物３Ｄ打印在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用思路。（Ａ）擠出式逡逑生物３Ｄ打印系統(tǒng)的組成；（Ｂ）生物３Ｄ打印在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用思路。逡逑１．２．１生物３Ｄ打印噴頭對(duì)細(xì)胞活性的影響逡逑２２逡逑

相同打印墨水和相同打印速度的前提下，打印噴頭的內(nèi)徑越小，打印時(shí)所需要的逡逑氣壓就越大；由于打印條的直徑不同，因此打印組織的孔徑大小差異明顯，打印逡逑噴頭的內(nèi)徑越小，打印組織的孔隙率就越大。如圖１－２邋（Ａ）所示，在使用鼠表皮逡逑干細(xì)胞作為種子細(xì)胞時(shí)，三種內(nèi)徑的噴頭打印后即刻（Ｄ０）組織中表皮千細(xì)胞的逡逑活性有明顯的差異：２１０邋ｙｍ噴頭打印的活細(xì)胞比例為８５．２％，明顯低于３４０邋ｕｍ逡逑和４２０邋ｕｍ噴頭打印后的活細(xì)胞比例（均＞９０％），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義０＜0．0５），逡逑３４０邋ｕ邋ｍ和４２０邋Ｗ邋ｍ噴頭打印后的活細(xì)胞比例之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ｐ＞０．０５）。逡逑如圖１－２邋（Ｂ）所示，表皮干細(xì)胞在經(jīng)過三種不同打印噴頭時(shí)所受到的剪切應(yīng)力明逡逑顯不同：２１０邋ｕｍ噴頭對(duì)細(xì)胞的剪切應(yīng)力最大，明顯高于３４０邋ｕｍ和４２０邋ｕｍ噴頭，逡逑差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ｐ＜０．０１）；邋３４０邋ｕｍ噴頭對(duì)細(xì)胞的剪切應(yīng)力稍大于４２０ｕｍ噴逡逑頭，二者差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（／？＞0．0５）。逡逑Ａ邐ｇ邐ｍｉ逡逑１０－Ｔｔ邐邐邐．邐邐邐１邐邐邐ｒ５００逡逑１００１邐ｍ邋ｄｉ邐ｌ邐，逡逑１邋ｉｉｉｉｉｉ邋ｉｉｉｉｉｉ逡逑２１０｜ｊｍ邐３４０Ｍｍ邐４２０ｐｍ邐邐＇邐＾邐邐＾￣４

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張翠萍;付小兵;陳鵬;包曉霞;孫同柱;;去分化表皮干細(xì)胞的來源鑒定和分析[J];感染、炎癥、修復(fù);2009年04期

2 王瑤;劉志躍;劉文忠;李建福;;表皮干細(xì)胞表面標(biāo)志物的研究進(jìn)展[J];感染、炎癥、修復(fù);2010年01期

3 王麗娟;孫耀蘭;楊雪;王友亮;楊曉;;小鼠表皮干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)[J];生物技術(shù)通訊;2011年03期

4 袁德品;牛扶幼;王喜梅;喬曉俊;李永濤;;表皮干細(xì)胞及其與糖尿病創(chuàng)面修復(fù)研究[J];糖尿病天地(臨床);2010年05期

5 孫曉艷;付小兵;;表皮干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J];感染.炎癥.修復(fù);2008年01期

6 田田;李英春;;胚胎干細(xì)胞源性表皮干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J];組織工程與重建外科雜志;2008年04期

7 廣e

本文編號(hào)：2730674