發(fā)布時(shí)間：2020-06-18 09:42

【摘要】：目前骨科常用的內(nèi)植入物材料在植入機(jī)體后通常都會(huì)受宿主反應(yīng)的影響,特別是與巨噬細(xì)胞相關(guān)的免疫反應(yīng),在后期骨愈合過(guò)程中起著重要作用。因此,適當(dāng)?shù)恼{(diào)控局部免疫反應(yīng),通過(guò)構(gòu)建具有骨-免疫調(diào)節(jié)功能的生物材料以作為骨科內(nèi)植入物是一種具有良好前景的改良策略。在這項(xiàng)研究中,我們研究了負(fù)載銀納米顆粒的二氧化鈦納米管(Ag@TiO_2-NTs)對(duì)巨噬細(xì)胞的生物學(xué)行為以及局部骨免疫微環(huán)境的影響。我們發(fā)現(xiàn)對(duì)生物材料進(jìn)行表面修飾能夠高效的調(diào)控巨噬細(xì)胞的生物學(xué)行,例如細(xì)胞粘附,細(xì)胞形態(tài)和增殖分化。Ag@TiO_2-NTs能夠?qū)⒕奘杉?xì)胞極化成M2型,并營(yíng)造良好的局部骨免疫微環(huán)境。此外,我們還深入研究了生物材料的納米形貌和巨噬細(xì)胞極化之間的潛在機(jī)制,發(fā)現(xiàn)Ag@TiO_2-NTs具有良好的抗氧化應(yīng)激能力和活性氧清除能力。由于自噬能夠抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧和炎癥小體的產(chǎn)生,因此我們推測(cè)Ag@TiO_2-NTs能夠通過(guò)激活材料表面巨噬細(xì)胞中的保護(hù)性自噬,進(jìn)而清除巨噬細(xì)胞內(nèi)的活性氧以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化,從而產(chǎn)生良好的骨免疫微環(huán)境。為了驗(yàn)證我們的設(shè)想,我們使用qPCR,western blot和ELISA等實(shí)驗(yàn)技術(shù)來(lái)檢測(cè)巨噬細(xì)胞M1型/M2型的極化狀態(tài),如巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物iNOS、TNF-α、ARG、TGF-β以及巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬水平的表達(dá)如p62、Beclin-1和LC3B。之后,我們使用DC-FHDA探針檢測(cè)了巨噬細(xì)胞中的ROS含量,結(jié)果顯示在Ag@TiO_2-NTs上生長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞比對(duì)照組表達(dá)顯著增多的M2型標(biāo)志物(ARG、TGF-β),更少的M1型標(biāo)志物(iNOS、TNF-α)以及更高的自噬水平和更少的細(xì)胞內(nèi)活性氧含量。為了進(jìn)一步探索細(xì)胞內(nèi)保護(hù)性自噬水平對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響,我們使用3-甲基腺嘌呤(3-MA)和雷帕霉素(Rapa)來(lái)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞內(nèi)的自噬水平,并發(fā)巨噬細(xì)胞內(nèi)較高的自噬水平傾向于極化成M2型巨噬細(xì)胞,同時(shí)也抑制了M1型巨噬細(xì)胞的極化。然后,我們檢測(cè)了Ag@TiO_2-NTs在體外和體內(nèi)構(gòu)建的骨免疫微環(huán)境,我們通過(guò)構(gòu)建體外間接共培養(yǎng)模型,使用不同材料來(lái)源的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1,并使用qPCR觀測(cè)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的成骨基因(Runx2,ALP,OCN和OPG)以及通過(guò)茜素紅染色和堿性磷酸酶染色觀察細(xì)胞外基質(zhì)沉積。為評(píng)估其體內(nèi)成骨效應(yīng),我們使用SD大鼠脛骨缺損模型,利用X線和micro-CT檢測(cè)其骨愈合情況,證明了Ag@TiO_2-NTs能夠通過(guò)產(chǎn)生骨免疫微環(huán)境刺激新骨形成。綜上所述,我們的研究表明Ag@TiO_2-NTs能夠通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)保護(hù)性自噬,清除局部不良的氧化應(yīng)激環(huán)境進(jìn)而調(diào)控局部微環(huán)境,抑制巨噬細(xì)胞向M1型極化,同時(shí)促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化為M2型,最終營(yíng)造優(yōu)異的成骨-免疫微環(huán)境。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R68;R318.08
【圖文】：

?中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文18三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 表面表征和 Ag +釋放通過(guò)陽(yáng)極氧化在60V下1小時(shí)制備的樣品的納米結(jié)構(gòu)和表面表征如圖1 所示.Ti，TiO2-NTs 和 Ag@TiO2-NT 的 X 射線光電子能譜圖如圖 1A所示，表明 Ag 納米粒子成功地分布在 TiO2-NTs 上。圖 1B 顯示了Ag@TiO2-NT 在第 1 天（80.2％），3（15.7％），5（1.8％），7（1.38％）和 10（0.9％）的 Ag 離子釋放曲線，總 Ag 濃度為 0.2ppm。水接觸角（圖 1C）是影響生物相容性的重要因素，Ti 為 53.4°

2-NTs 的表面上呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形。圖2C顯示了在不同樣品表面孵育24h,48h和72h后，RAW 264.7細(xì)胞在樣品上的細(xì)胞活力和增殖情況。第 1d,2d 和 3d，不同表面上的巨噬細(xì)胞活力相當(dāng)，沒(méi)有顯著差異，表明各個(gè)樣品均無(wú)顯著細(xì)胞毒性。圖 2：巨噬細(xì)胞形態(tài)：掃描電鏡（A），鬼筆環(huán)肽/ DAPI 染色（B），CCK-8 檢測(cè)各樣品表面巨噬細(xì)胞活力(C)3.3 巨噬細(xì)胞在不同表面上的極化和自噬相關(guān)基因表達(dá)將未激活的 M0 型巨噬細(xì)胞在不同樣品表面上培養(yǎng) 24 小時(shí)后，通過(guò)免疫熒光染色（LC3B，圖 3A 和 3D）、qPCR（圖 4）和蛋白質(zhì)印跡（圖 3F）分析與巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)的基因和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明

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本文編號(hào)：2719056